利尿劑和滲水利濕中藥對(duì)正常大鼠尿液水通道蛋白-2排泄的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、【目的】 上世紀(jì)90年代初發(fā)現(xiàn)的水通道蛋白家族是近年來的研究熱點(diǎn)，它的發(fā)現(xiàn)成為人們了解水分子在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的新里程碑。而水通道蛋白2(AQP2)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最具病理生理意義的水通道蛋白之一，是維持機(jī)體水平衡調(diào)節(jié)的必需物質(zhì)。AQP2主要分布在腎臟集合管主細(xì)胞胞漿內(nèi)和管腔側(cè)細(xì)胞膜上，在機(jī)體內(nèi)主要受抗利尿激素(血管加壓素，AVP)經(jīng)血管加壓素2型受體(V<,2>R)調(diào)節(jié)，對(duì)尿液的重吸收起著較大作用。其中部分腎臟AQP2蛋白可脫

2、落于腎小管腔內(nèi)而被尿液沖出，尿液AQP2是反映AVP作用的內(nèi)在生物學(xué)指標(biāo)。在許多伴有水代謝失衡的疾病中，如充血性心力衰竭、肝硬化、腎病綜合癥等，往往存在有AQP2的表達(dá)異常，因此尋找一些能干預(yù)AQP2基因表達(dá)的藥物具有較為重大的意義。利尿劑在臨床上被廣泛運(yùn)用，尤其是在充血性心力衰竭的治療中取得顯著的療效，雖然目前的研究中有一些關(guān)于利尿劑對(duì)于尿液AQP2的影響，但是對(duì)于腎臟AQP2基因及蛋白的改變卻知之較少。本實(shí)驗(yàn)就正常生理情況下，常用利

3、尿劑對(duì)大鼠腎臟AQP2基因和尿液中AQP2的改變進(jìn)行了研究。另外目前西藥對(duì)于AQP2的影響研究國內(nèi)外均有報(bào)道，而中藥方面的研究較少。而中藥是我國一個(gè)寶貴資源，在某些臨床疾病治療中使用中藥可以起到較好的效果。 根據(jù)已有中藥的相關(guān)信息，選取幾味滲水利濕中草藥作用于實(shí)驗(yàn)大鼠，觀察灌藥侯檢測其對(duì)腎臟及尿液AQP2的影響，試圖篩選出一至兩種能干預(yù)AQP2表達(dá)的中藥或者單體。 【方法】 人工合成AQP2蛋白C末端的CELHS

4、PQSLPRGSKA多肽片段，并與牛血清白蛋白偶聯(lián)作為標(biāo)準(zhǔn)品，將AQP2多肽與鑰孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpethemocyanin，KLH)相連后免疫家兔，獲得兔抗鼠AQP2多克隆抗體。所有大鼠均單獨(dú)飼養(yǎng)在代謝籠中，自由進(jìn)食，收集尿液。實(shí)驗(yàn)一，對(duì)正常大鼠分別應(yīng)用呋塞米(20mg/d·kg)和雙氫克尿噻(25mg/d·kg)和安體舒通(20mg/d·kg)，經(jīng)胃灌入，大鼠自由進(jìn)水，連續(xù)收集尿液，記錄尿量，用間接ELISA檢測尿液

5、AQP2的變化、對(duì)用藥后7天的大鼠腎內(nèi)髓質(zhì)分別用RT-PCR和免疫印跡法(Western blotting)檢測V<,2>R及AQP2 mRNA和AQP2蛋白。實(shí)驗(yàn)二，從常用的滲水利濕藥物中選取常用且利尿效果明顯的中藥做為初篩對(duì)象，連續(xù)灌胃7天，大鼠自由進(jìn)水，連續(xù)收集尿液，記錄尿量，用間接ELISA法檢測尿液AQP2的變化；實(shí)驗(yàn)三，對(duì)初篩過程中尿液AQP2有改變意義的茯苓，豬苓兩種藥物延長灌藥時(shí)間至15天，對(duì)用藥后15天的大鼠腎內(nèi)髓質(zhì)分

6、別用RT-PCR和免疫印跡法(Western blotting)檢測V<,2>R及AQP2 tuRNA和AQP2蛋白。 [結(jié)果] 一、呋塞米、雙氫克尿噻及安體舒通對(duì)正常大鼠血鈉、尿量、尿滲量用藥7天呋塞米組、雙氫克尿噻組和安體舒通組與對(duì)照組相比，血鈉無顯著差異。呋塞米組、雙氫克尿噻組和安體舒通組大鼠尿量均顯著增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；呋噻米組在用藥后第4天達(dá)尿量峰值。用藥后，呋噻米組和雙氫克尿噻組尿滲量改變有顯

7、著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，呋噻米組尿滲量降低，雙氫克尿噻組尿滲量升高，安體舒通組尿滲量無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 二、呋塞米、雙氫克尿噻及安體舒通對(duì)正常大鼠尿液AQP2濃度和排泄率的影響正常組大鼠用藥前后尿液AQP2濃度無顯著差異，應(yīng)用三種利尿藥后尿液AQP2濃度均有顯著增加(P<0.001)。但三組之間無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；三組藥物均引起尿液中AQP2的排泄率顯著增加(JP<0.001)，呋噻米強(qiáng)于雙氫克尿噻和安體舒通。

8、三、呋塞米、雙氫克尿噻和安體舒通對(duì)正常大鼠腎內(nèi)髓質(zhì)中AQP2及V<,2>R mRNA和AQP2蛋白的影響用藥后7天，呋塞米組、雙氫克尿噻組、安體舒通組的AQP2/β-actinmRNA光密度值和AQP2蛋白與對(duì)照組相比，呋塞米組AQP2 mRNA和蛋白顯著升高(P<0.001)；雙氫克尿噻組AQP2 mRNA和蛋白顯著減少(P<0.001)；安體舒通組AQP2 mRNA和蛋白則無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。呋塞米組、安體舒通組和雙氫克尿噻組腎內(nèi)髓質(zhì)

9、中V<,2>-R/β-actin mRNA光密度值與對(duì)照組比較，呋塞米組V<,2>-R mRNA顯著提高(P<0.001)，雙氫克尿噻組V<,2>-R mRNA顯著減少(P<0.001)，安體舒通組則無顯著改變。 四、幾種中藥用藥7天對(duì)正常大鼠尿量和尿液AQP2濃度的影響在選用的八種中藥中，提氣類中藥人參、黨參、當(dāng)歸尿量和AQP2濃度改變無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而澤瀉和葶藶子組雖然尿量有所增加，但無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而用

10、藥前后尿液AQP2濃度無差異。茯苓組和豬苓組尿量的增加具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，尿液中AQP2濃度降低有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 五、豬苓、茯苓用藥15天對(duì)正常大鼠血鈉、尿量和尿滲量的影響用藥15天后，豬苓組、茯苓組和對(duì)照組相比，血鈉無顯著差異。尿量增加有顯著性差異(P<0.001)，并隨時(shí)間延長尿量增加明顯，尿滲量降低有顯著性差異(P<0.001)， 六、豬苓、茯苓用藥15天對(duì)正常大鼠尿液AQP2的影響豬苓組和茯苓

11、組在用藥前5天左右尿液AQP2濃度呈顯著下降趨勢(shì)，其后AQP2濃度有所回升，至用藥15天與用藥前比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而豬苓組AQP2排泄率在用藥后第5天減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其后有所回升，至用藥第9天左右開始有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.037)。茯苓組在用藥后第5天引起AQP2排泄率減少有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其后排泄率有所回升，至第9天左右有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，豬苓組引起AQP2排泄增加的效果強(qiáng)于茯苓組。 七、豬苓、茯苓對(duì)正常大鼠腎內(nèi)髓

12、質(zhì)中AQP2及V<,2>-R mRNA和AQP2蛋白的影響用藥后15天，豬苓組、茯苓組、AQP2/β-actin mRNA和AQP2蛋白光密度值與對(duì)照組相比存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=121.642，P=0.001)，豬苓組和茯苓組AQP2 mRNA均顯著降低(P<0.001)，且豬苓改變比茯苓明顯(P<0.001)，而V<,2>-R/β-actin mRNA與對(duì)照組比較均減少有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但兩者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

13、 [結(jié)論] 一、常用利尿劑呋塞米、雙氫克尿噻和安體舒通都能增加正常大鼠尿量，引起尿液中．AQP2排泄的增加，但呋塞米降低尿滲量、增加腎臟AQP2和V<,2>-R的表達(dá)，同時(shí)增加腎臟AQP2蛋白表達(dá)；雙氫克尿噻則升高尿滲量，減少腎臟AQP2和V<,2>-R mRNA的表達(dá)；安體舒通引起腎臟AQP2基因表達(dá)改變不明顯。 二、選用的八種中藥中，茯苓和豬苓均引起正常大鼠尿量增加和尿滲量的降低，并在用藥早期降低尿液中AQP2排泄