腦性癱瘓病因及其修復(fù)機(jī)制的系列研究.pdf

1、研究背景：
　　 腦性癱瘓（cerebral palsy, CP，腦癱）是自受孕開始至嬰兒期非進(jìn)行性腦損傷和發(fā)育缺陷所導(dǎo)致的一組綜合征，主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)障礙及姿勢異常，可伴有或不伴有精神發(fā)育遲緩及癲癇，是兒童時(shí)期最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，嚴(yán)重影響兒童健康及人口素質(zhì)。隨著圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展、產(chǎn)婦保健水平的提高，早產(chǎn)兒、低出生體重兒的存活率顯著增加，與其相對的是，早產(chǎn)兒腦性癱瘓的發(fā)病率卻呈上升趨勢。2006年Kirby等對美國四個(gè)州8歲以

2、內(nèi)兒童腦性癱瘓進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)，患病率為2.9-3.8‰，平均為3.3‰。1997-1998年，我國六省（區(qū)）l歲、2歲、3歲、4歲、5歲、6歲年齡組患病率分別為2.26‰、2.24‰、1.94‰、1.58‰、1.8‰、1.77‰，平均患病率為1.92‰。我國現(xiàn)有腦性癱瘓患兒400～500萬，致殘率為42％～45％，每年新增腦性癱瘓患兒3～4萬，已成為新的臨床、公共衛(wèi)生和社會問題。目前各國對腦性癱瘓一般采取三級防治措施。一級防治是找出致病原

3、因，避免腦性癱瘓的出現(xiàn);二級防治是對腦性癱瘓患兒早期發(fā)現(xiàn)、早期干預(yù)，盡量減少或減輕后遺癥;三級防治是對已經(jīng)形成腦癱的患兒堅(jiān)持康復(fù)訓(xùn)練，盡可能地改善功能，最大限度地提高生存質(zhì)量。腦性癱瘓防治的重點(diǎn)在于完善的一級防治及有效的二級防治手段。腦性癱瘓研究的重點(diǎn)集中在病因分析、致病機(jī)制以及修復(fù)機(jī)制三個(gè)方面。但其核心仍是發(fā)病機(jī)制的探索。
　　 腦性癱瘓的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，是自受孕開始至嬰兒期非進(jìn)行性腦損傷和發(fā)育缺陷所導(dǎo)致的一組綜合征。所

4、有可能導(dǎo)致胎兒腦損傷的危險(xiǎn)因素統(tǒng)稱為腦癱的高危因素。研究小兒腦性癱瘓病因及相關(guān)圍產(chǎn)期高危因素，對降低該病的患病率、早期監(jiān)測及干預(yù)、減少致殘率、提高我國人口素質(zhì)具有重要意義，這也是腦癱一級防治的核心和根本。目前的資料顯示，早產(chǎn)/低出生體重、新生兒窒息/HIE、新生兒高膽紅素血癥和宮內(nèi)感染是最主要的圍產(chǎn)高危因素。隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，尤其是產(chǎn)科及NICU水平的逐年提高，圍產(chǎn)高危因素的構(gòu)成也在不斷發(fā)生變化。但目前尚缺乏長時(shí)間跨度的圍產(chǎn)期高危因素

5、變化的研究。本課題第一部分即對近10年來新入院腦癱患兒的圍產(chǎn)高危因素進(jìn)行調(diào)查，試圖找到近年來圍產(chǎn)高危因素的構(gòu)成及其變化，為我國腦癱的一級防治提供臨床證據(jù)。
　　 由于腦性癱瘓致病機(jī)制的不明確，由此造成腦癱治療方法的混亂和不確定，為腦癱的二級防治帶來了困難。目前，國內(nèi)外尚無根治腦癱的治療方法?？祻?fù)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是得到公認(rèn)的有效治療和改善腦癱癥狀的治療方法之一，但多數(shù)的研究限于臨床觀察，對于運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練起效的機(jī)理闡述較少。缺氧缺血性腦損傷（H

6、ypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是腦性癱瘓的主要致病機(jī)制之一，長期是腦癱研究的熱點(diǎn)。為了進(jìn)一步深入探討運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練治療腦癱的機(jī)理，本課題第二部分選用新生大鼠HIBD模型，觀察早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷遠(yuǎn)期神經(jīng)功能、病理改變、空間學(xué)習(xí)記憶能力、感覺運(yùn)動(dòng)功能、超微結(jié)構(gòu)的影響。試圖探討早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對HIBD新生大鼠作用的機(jī)理，為早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練治療腦癱提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 無論是一級還是二級防治

7、，其根本仍在于明確腦癱確切的致病機(jī)制。近年來關(guān)于腦癱致病機(jī)制的許多研究證實(shí)，腦癱具有明顯的遺傳易感性。在對瑞典1959～1970年腦性癱瘓患兒調(diào)查中發(fā)現(xiàn)足月兒偏癱占60％、痙攣型雙癱占45％，早產(chǎn)兒痙攣型雙癱占32％，幾乎全部單純型共濟(jì)失調(diào)都與遺傳有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子α、甘露糖結(jié)合凝集素基因的多態(tài)性會增加腦性癱瘓的危險(xiǎn)性。位于19號染色體19q132上的ApoE基因，此基因與神經(jīng)細(xì)胞表面LDL和VLDL受體結(jié)合進(jìn)入神經(jīng)元細(xì)胞，對維

8、持、修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，維持神經(jīng)遞質(zhì)和參與腦損傷后修復(fù)起到重要作用。攜帶ApoE E4基因或等位基因E2，發(fā)生腦性癱瘓的風(fēng)險(xiǎn)性較未攜帶者明顯增加。ApoE4與認(rèn)知相關(guān)，可造成海馬萎縮及其連接性喪失，進(jìn)而造成記憶障礙，影響邏輯能力導(dǎo)致智力低下;還可以導(dǎo)致膽堿能遞質(zhì)減少，進(jìn)而出現(xiàn)精神運(yùn)動(dòng)視覺障礙。位于染色體2q37上的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT1Al)基因突變是導(dǎo)致新生兒高膽紅素血癥和導(dǎo)致不隨意運(yùn)動(dòng)型腦性癱瘓的重要因素之一。UGT1

9、A1基因通過啟動(dòng)子與TATA結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始DNA序列，而它突變可造成DNA轉(zhuǎn)錄起始頻率和精確性異常。純合子UGT1A1基因突變可影響葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)使酶活性下降，導(dǎo)致新生兒血清總膽紅素顯著升高。
　　 臨床觀察也發(fā)現(xiàn)，暴露在相同高危因素下的不同胎兒或新生兒，其臨床結(jié)局差別甚大。這使我們想到，腦癱的致病機(jī)制中，遺傳因素及微觀的生物學(xué)通路皆有可能起到非常重要的作用。腦癱是一種嚴(yán)重影響人類健康和生命的復(fù)雜疾病。某些生物學(xué)通路在

10、其疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。隨著生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的飛速發(fā)展，以基因芯片數(shù)據(jù)為代表的海量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的產(chǎn)出，通過一系列算法和模型整合和分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，鑒定和模擬疾病相關(guān)的生物學(xué)通路，發(fā)現(xiàn)了很多重要的生物學(xué)結(jié)論，解釋了遺傳因素及微觀的生物學(xué)通路在腦癱致病中的作用。因此本課題第三部分選取了臨床上最常見的腦癱類型——早產(chǎn)兒腦室周圍白質(zhì)軟化癥(Periventricular leukomalacia，PVL)作為研究對象，通過對患兒和

11、健康兒童血漿中microRNA基因芯片的表達(dá)差異進(jìn)行分析，探討microRNA在PVL發(fā)病中的作用，為進(jìn)一步了解PVL的微觀生物學(xué)通路發(fā)病機(jī)理，為將來PVL的宮內(nèi)超早期診斷以及PVL的基因治療探索出一條新的思路。
　　 第一部分：
　　 目的:比較十年來腦性癱瘓患兒相關(guān)高危因素構(gòu)成，探索伴隨醫(yī)療水平提高等社會大環(huán)境的變化下，腦性癱瘓高危因素的變化趨勢，為腦性癱瘓的預(yù)防及治療提供依據(jù)。
　　 方法:回顧性統(tǒng)計(jì)分析2

12、003年至2012年間入院首次診斷為腦性癱瘓的病例中患兒的病例數(shù)、性別、年齡及高危因素等構(gòu)成，并對各年份腦癱患兒高危因素進(jìn)行對比分析。
　　 結(jié)果:納入共1040例病例，其中男性750例，女性290例，男女比例為2.59∶1。患兒年齡＜1歲147例，占14.1％;1～3歲440例，占42.3％;3～6歲294例，占28.3％;≥6歲159例，占15.3％;在10年腦癱病例近40種高危因素中，早產(chǎn)仍是最重要的高危因素，其次是產(chǎn)時(shí)窒

13、息、黃疸、胎膜早破及不良妊娠。10年間高危因素中產(chǎn)前、產(chǎn)時(shí)、產(chǎn)后因素構(gòu)成有差異（x2=72.234，P＜0.05），宮內(nèi)窘迫、產(chǎn)時(shí)窒息、產(chǎn)后窒息及不明確時(shí)間HIE的構(gòu)成有差異(x2=93.722，P＜0.05)。
　　 結(jié)論:①本研究發(fā)現(xiàn)腦性癱瘓就診患兒中存在明顯的男女性別差異，男性多于女性;②患兒首次就診年齡偏大，說明高危兒早期發(fā)育監(jiān)測及早期干預(yù)工作依然存在較多困難，加強(qiáng)教育，提高對腦癱的認(rèn)識是關(guān)鍵;③產(chǎn)前因素所占比重有上升趨

14、勢，早產(chǎn)仍是最首位的高危因素，其次是產(chǎn)時(shí)窒息、黃疸、胎膜早破及不良妊娠。不同時(shí)間窒息中產(chǎn)前因素所占比例呈上升趨勢，加強(qiáng)孕期保健，提高產(chǎn)科技術(shù)仍要作為目前腦性癱瘓防治的重點(diǎn)。
　　 第二部分：
　　 目的:探討早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷遠(yuǎn)期神經(jīng)功能、病理改變、空間學(xué)習(xí)記憶能力、感覺運(yùn)動(dòng)功能、超微結(jié)構(gòu)的影響。
　　 方法:90只7d齡SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為運(yùn)動(dòng)組、對照組和假手術(shù)組，每組各30只。運(yùn)動(dòng)組

15、和對照組制備成新生兒缺氧缺血性腦損傷模型，且運(yùn)動(dòng)組于缺氧缺血性腦損傷后1周開始每天給予抓握、旋轉(zhuǎn)、行走、平衡等訓(xùn)練。4周后進(jìn)行神經(jīng)功能評分，尼氏染色計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)和皮層額部神經(jīng)元數(shù)量，并檢測突觸素、c-fos表達(dá)水平;水迷宮檢測各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力和感覺功能;透射電鏡觀察突觸和神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果:運(yùn)動(dòng)組大鼠神經(jīng)功能評分、空間學(xué)習(xí)記憶能力均優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。對照組大鼠左側(cè)海馬CA1區(qū)及

16、皮層額部尼氏染色陽性神經(jīng)元數(shù)目較運(yùn)動(dòng)組和假手術(shù)組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=45.550，P＜0.05;F=82.521，P＜0.05)。運(yùn)動(dòng)組大鼠海馬CA1和皮層額部突觸素、c-fos表達(dá)水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(突觸素:F=81.747，P＜0.05;F=26.865,P＜0.05。c-fos:F=680.750,P＜0.05;F=296.617,P＜0.05)。透射電鏡下顯示對照組大鼠海馬和皮層突觸損傷嚴(yán)重，神經(jīng)氈

17、區(qū)突觸減少，突觸前膨大腫脹、輪廓不清晰，突觸小泡溶解、空泡形成，突觸后致密區(qū)變薄、薄厚不均，而運(yùn)動(dòng)組未見明顯異常。
　　 結(jié)論:早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可減少缺氧缺血性腦損傷后海馬和皮層額部神經(jīng)元損傷，增強(qiáng)突觸可塑性，從而改善缺氧缺血性腦損傷后遠(yuǎn)期神經(jīng)功能，其中突觸素和c-fos在海馬和皮層額部表達(dá)增強(qiáng)可能是其改善的機(jī)制之一。
　　 第三部分：
　　 目的:比較腦室周圍白質(zhì)軟化(periventricular leukoma

18、lacia，PVL)患兒和健康兒童血清中microRNA基因芯片的差異表達(dá)，篩選出顯著差異表達(dá)譜，為PVL早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷提供生物學(xué)標(biāo)記物。并為下一步探討microRNA在PVL疾病中的發(fā)病機(jī)制，提供一條新的思路。
　　 方法:收集7例PVL患兒和5例健康兒童的全血，2000r/min離心10min分離血清，從血清中提取RNA，使用Exiqon公司的microRNA芯片篩選microRNA表達(dá)譜。以microRNA芯片表達(dá)結(jié)果

19、為基礎(chǔ)，采用microcosm，miranda和targetscan三個(gè)數(shù)據(jù)庫及GO分析，篩選出與神經(jīng)、血管、遺傳發(fā)育靶基因相關(guān)的10個(gè)microRNA: hsa-miR-133b、hsa-miR-323a-3p、hsa-miR-330-3p、hsa-miR-654-5p、hsa-miR-498、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-638、hsa-miR-149-3p、hsa-miR-1228-5p、hsa-miR-671-3

20、p，對其進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。
　　 結(jié)果:PVL患兒中microRNA表達(dá)譜與健康患兒相比較有顯著差異，在3100個(gè)microRNA中，有100個(gè)microRNA存在差異表達(dá)，34個(gè)microRNA表達(dá)上調(diào)，66個(gè)表達(dá)下調(diào)。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證10個(gè)篩選出的microRNA，其中hsa-miR-323a-3p、hsa-miR-671-3p、hsa-miR-330-3p、hsa-miR-654-5p、hsa-miR

21、-498、hsa-miR-149-3p、hsa-miR-1228-5p共7個(gè)與microRNA芯片結(jié)果具有同樣趨勢。
　　 結(jié)論:部分microRNA在PVL疾病中的表達(dá)有顯著差異，提示microRNA有可能與PVL的發(fā)病相關(guān)，為今后PVL的早期診斷、生物學(xué)機(jī)制探討和基因治療提供新的思路。
　　 全文結(jié)論
　　 1.腦性癱瘓就診患兒中存在明顯的男女性別差異;患兒就診年齡偏大;10年間產(chǎn)前因素所占比重有上升趨勢，不

22、同時(shí)間窒息中產(chǎn)前因素所占比例呈上升趨勢。提示，加強(qiáng)孕期保健及胎兒發(fā)育監(jiān)測、提高產(chǎn)科技術(shù)依然是目前腦性癱瘓?jiān)缙诜乐蔚闹攸c(diǎn)。
　　 2.早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可減少缺氧缺血性腦損傷后海馬和皮層額部神經(jīng)元損傷，增強(qiáng)突觸可塑性，從而改善缺氧缺血性腦損傷后遠(yuǎn)期神經(jīng)功能，其中突觸素和c-fos在海馬和皮層額部表達(dá)增強(qiáng)可能是其改善的機(jī)制之一。
　　 3.部分microRNA在PVL疾病中的表達(dá)有顯著差異，提示microRNA有可能與PVL的發(fā)病

23、相關(guān)，為今后PVL的早期診斷、生物學(xué)機(jī)制探討和基因治療提供新的思路。
　　 展望：
　　 1.擴(kuò)大PVL病例數(shù)（100例）進(jìn)一步驗(yàn)證microRNA芯片結(jié)果準(zhǔn)確性，從而作為PVL早期診斷的生物學(xué)標(biāo)記物。
　　 2.microRNA在PVL發(fā)病中關(guān)于神經(jīng)、血管、遺傳發(fā)育等生物學(xué)通路中的作用，是我們今后探討的重點(diǎn)，希望能從微觀角度挖掘其致病的分子機(jī)理。
　　 3.早期功能訓(xùn)練結(jié)合基因工程干預(yù)（上調(diào)或下調(diào)相關(guān)的