芳香化酶抑制劑對體外培養(yǎng)子宮內膜異位癥在位內膜細胞的影響.pdf

1、背景:子宮內膜異位癥(endometriosis,EMs,簡稱內異癥)是多發(fā)病,近年來發(fā)病率有明顯上升的趨勢,其發(fā)病機制尚未完全明了,對策有限。故尋找相關病因是目前的研究熱點。近年來,關于芳香化酶(P450arom)研究較多,Matsuzaki等研究發(fā)現(xiàn):在EMs患者的在位和異位內膜組織中發(fā)現(xiàn)芳香化酶異常表達,而在正常子宮內膜細胞中卻未發(fā)現(xiàn)芳香化酶的表達。說明P450arom在EMs的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用,故芳香化酶抑制劑作為一種治

2、療EMs的新方法受到人們關注。近年來,由于倫理學問題,很難在人體進行EMs的對照研究,尤其不可能隨機進行各種類藥物的干預實驗和刺激,芳香化酶抑制劑在EMs中的應用研究轉向細胞模型,本研究利用體外培養(yǎng)絀胞模型來研究芳香化酶抑制劑來曲唑。進一步證實來曲唑對EMs的治療效果。此實驗將有望為芳香化酶抑制劑治療EMs提供理論依據(jù)。
　　 目的:
　　 1.通過對來曲唑作為芳香化酶抑制劑對體外培養(yǎng)EMs在位內膜細胞的影響探討來曲唑在

3、EMs治療中的作用。
　　 2.觀察來曲唑對體外培養(yǎng)EMs在位內膜細胞產(chǎn)生抑制作用的最佳濃度和時間。
　　 3.電鏡下觀察正常子宮內膜細胞與體外培養(yǎng)EMs在位內膜細胞形態(tài)學的差別。
　　 方法:
　　 1.培養(yǎng)子宮內膜腺上皮及間質細胞。
　　 參照Ryna等的方法,略有改動。
　　 2.應用免疫組化法進行細胞鑒定。①基質細胞波形蛋白染色陽性,CK19染色陰性。陽性細胞胞漿呈棕黃色,核為藍色

4、,陽性率為93％。②腺上皮細胞CK19染色陽性,波形蛋白染色陰性。陽性細胞胞漿呈棕黃色,核為藍色,陽性率為90％。說明可以滿足進一步實驗的要求。
　　 3.電鏡下觀察細胞形態(tài)。制備子宮內膜細胞切片,在電鏡下觀察正常子宮內膜細胞與EMs在位內膜細胞形態(tài)學差異。
　　 4.MTT法檢測不同濃度來曲唑抑制子宮內膜細胞增殖作用。將EMs在位內膜細胞隨機分為五組,每組設5個復孔,分別加入不同濃度來曲唑,即1×10-10mmol/L

5、,1×10-9mmol/L,1×10-8mmol/L,1×10-7mmol/L。以不加來曲唑組為陰性對照。分別培養(yǎng)24、48、72小時后,MTT處理測定各孔492nm波長吸收值,記錄結果。取OD平均值繪制生長曲線。
　　 5.用流式細胞儀檢測細胞周期、增殖指數(shù)。將細胞以1×105/ml的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中,24h后,用不同濃度來曲唑即1×10-10mmol/L,1×10-9mmol/L,1×10-8mmol/L,1×1

6、0-7mmol/L進行刺激,同時設立空白對照組,刺激時間為48h。達到預定時間后,收集細胞,采用PI染色流式細胞儀檢測細胞周期。每種刺激條件的樣本重復5次。
　　 結果:
　　 1.在電鏡下觀察細胞學形態(tài)未發(fā)現(xiàn)正常子宮內膜細胞與EMs在位內膜細胞特異性差異。
　　 2.MTT結果顯示:24小時后,1×10-7mmol/L來曲唑組與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各用藥組間比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P

7、>0.05)。48小時后,各用藥組與對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示各濃度來曲唑在作用48小時后對體外培養(yǎng)EMs在位內膜細胞均有抑制增殖作用。來曲唑濃度為1×10-7mmoUL,時對EMs在位內膜細胞體外增殖抑制作用明顯高于1×10-8mmol/L、1×10-9mmol/L、1×10-10mmol/L組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。72小時后,各用藥組與對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各藥物組間比較

8、(除1×10-8mmol/L與1×10-9mmol/L兩者比較),差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示來曲唑對EMs在位內膜細胞體外增殖抑制作用隨濃度增大而增大,呈劑量依賴性。相同濃度來曲唑作用24小時與48小時兩者比較,高濃度組(1×10-7mmol/L、1×10-8mmol/L)有明顯抑制細胞增殖作用。低濃度組(1×10-9mmol/L、l×10-10mmol/L)兩時間比較,差異無統(tǒng)計學意義。作用72小時后,各濃度組抑制細胞增

9、殖作用與作用24h、48h比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示來曲唑抑制細胞增殖的作用需要一定時間,一定濃度,時間越長,作用越強,濃度越大,作用越強。呈時間-濃度依賴性。濃度為1×10-7mmol/L來曲唑作用72h抑制作用最顯著。
　　 3.流式細胞術檢測結果發(fā)現(xiàn):各用藥組與對照組相比,其細胞增殖指數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示不同濃度來曲唑對EMs在位內膜細胞增殖均有抑制作用。各用藥組間比較(除1×10-8

10、mmol/L與1×10-9mmol/L兩者比較),差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明來曲唑對EMs在位內膜細胞抑制增殖作用呈劑量依賴關系,濃度越大,作用越強。
　　 來曲唑作用后的EMs在位內膜細胞分裂停滯在G0/G1期。
　　 與正常子宮內膜細胞比較,EMs在位內膜細胞增殖指數(shù)高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表示EMs在位內膜細胞增殖活性高于正常子宮內膜細胞。
　　 結論:
　　 1.來曲唑