鈣鎂離子環(huán)境改變對(duì)人惡性膠質(zhì)瘤原代細(xì)胞侵襲力影響的體外研究.pdf

1、背景和目的：膠質(zhì)細(xì)胞瘤是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤,占原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的40％。膠質(zhì)瘤易復(fù)發(fā)、預(yù)后差,其主要原因是膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)的生物學(xué)特性使各種治療措施難以達(dá)到治愈目的。而鈣離子在腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移中是一個(gè)關(guān)鍵的離子信號(hào);鎂離子作為天然的鈣離子拮抗劑,其對(duì)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的影響也值得關(guān)注。腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是由腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)成分共同參與完成的,其中的基本步驟是對(duì)ECM和血管基底膜的降解和破壞。實(shí)驗(yàn)證明,瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的能力與其誘

2、導(dǎo)產(chǎn)生蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)(Extra Cell Matrix,ECM)、基底膜的能力密切相關(guān)。在腫瘤組織中,基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與ECM的黏附,降解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)成分,增加腫瘤新生血管形成來(lái)參與腫瘤的侵襲生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)液加入鈣鎂離子可以改變腫瘤細(xì)胞分泌MMPs的能力,從而對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲力有所影響。原代培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng),是從供體取得離體細(xì)胞后在體外

3、進(jìn)行的首次培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的細(xì)胞因組織和細(xì)胞剛剛離體,生物學(xué)性狀未發(fā)生明顯變化,最接近和反映體內(nèi)的生長(zhǎng)特性。目前,已有部分人類的膠質(zhì)瘤細(xì)胞被成功培養(yǎng),其中以星形細(xì)胞瘤報(bào)道居多,而室管膜瘤細(xì)胞尤其是人類室管膜瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)國(guó)內(nèi)卻未有報(bào)道。傳統(tǒng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞分離法為酶消化法和機(jī)械分散法,本實(shí)驗(yàn)首次采用“機(jī)械分散法+胰酶消化法”的綜合分離方法培養(yǎng)星形細(xì)胞瘤細(xì)胞和室管膜瘤細(xì)胞,并將三種分離方法各自的特點(diǎn)加以對(duì)比,以期找出更為廉價(jià),有效的原代細(xì)胞的

4、培養(yǎng)方法。本實(shí)驗(yàn)在原代細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上通過(guò)體外調(diào)節(jié)鈣,鎂離子濃度的變化探討離子環(huán)境的改變對(duì)人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力的影響,從而進(jìn)一步探討膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)的分子機(jī)制。
　　材料和方法：1.取新鮮手術(shù)標(biāo)本并做常規(guī)病理檢查本實(shí)驗(yàn)取膠質(zhì)細(xì)胞瘤手術(shù)后的新鮮離體標(biāo)本,一部分送常規(guī)病理檢查,剩余大小約1cm×1cm×1cm的組織無(wú)菌包裹,送入無(wú)菌培養(yǎng)間培養(yǎng)。對(duì)用常規(guī)病理檢查(HE及免疫組化)證實(shí)為星形細(xì)胞瘤和室管膜瘤的標(biāo)本繼續(xù)培養(yǎng)。2.膠質(zhì)瘤

5、標(biāo)本的處理應(yīng)用機(jī)械分散法+胰酶消化法分離細(xì)胞。200目濾網(wǎng)過(guò)濾后的細(xì)胞懸液按800~1000 r/min離心5min后去上清,培養(yǎng)液重懸后調(diào)整細(xì)胞濃度并接種。3.膠質(zhì)瘤的原代培養(yǎng)用上述分離方法得到的細(xì)胞,細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)1×106/ml后,在DMEM培養(yǎng)基(加10％胎牛血清)、37℃、5％CO2條件下、培養(yǎng)板中培養(yǎng),每隔3~4d換培養(yǎng)液1次;細(xì)胞長(zhǎng)滿底部70％~80％后,用0.25％胰蛋白酶消化,細(xì)胞計(jì)數(shù),傳代。繼續(xù)培養(yǎng),對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀

6、察、免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定,取生長(zhǎng)良好的第三代細(xì)胞棄去其帶有FBS的DMEM培養(yǎng)液,加入新鮮的不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液,并在其內(nèi)添加鈣鎂離子,調(diào)節(jié)鈣離子濃度分別為0.8mmol/L,1.2mmol/L,1.6 mmol/L,2.0 mmol/L,調(diào)節(jié)鎂離子濃度分別為0.5 mmol/L,1.0 mmol/L,1.5mmol/L,2.0 mmol/L,不含鈣鎂離子的作為空白對(duì)照組。將這些細(xì)胞培養(yǎng)24時(shí)后取其細(xì)胞和上層懸液分別做Boyden c

7、hamber侵襲小室實(shí)驗(yàn)和聚丙烯酰胺明膠酶譜電泳。4.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察用倒置相差顯微鏡觀察活細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和生長(zhǎng)狀態(tài)的變化,觀察不同級(jí)別的星形細(xì)胞瘤和室管膜瘤的形態(tài)學(xué)和生長(zhǎng)狀態(tài)。5.免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定采用SP法,對(duì)星形細(xì)胞瘤檢測(cè)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、Ⅳ型膠原(CollagenⅣ)和巢蛋白(nestin)的表達(dá)。對(duì)室管膜瘤細(xì)胞檢測(cè)GFAP、CD99和EMA的表達(dá)。6.Boyden chamber實(shí)驗(yàn)Boyden chamber小室測(cè)定原

8、代培養(yǎng)的Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)星形細(xì)胞瘤細(xì)胞及Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)室管膜瘤細(xì)胞,在相同的培養(yǎng)時(shí)間和不同的培養(yǎng)條件下,觀察鈣鎂離子影響下的不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲力的差別。7.明膠酶譜法檢測(cè)MMP-2酶和酶原的表達(dá)情況。明膠酶譜法檢測(cè)不同濃度鈣鎂離子影響下的不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP-2酶和酶原的表達(dá)情況的差別,從而判斷體外鈣鎂離子濃度的不同對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲力影響的差別。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以上結(jié)果用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,數(shù)據(jù)結(jié)果采用(?)±S表示,方差

9、分析,以a=0.05為顯著性水平。
　　結(jié)果：1.常規(guī)病理檢查診斷為星形細(xì)胞瘤的手術(shù)標(biāo)本20例,共培養(yǎng)成活16例,其中Ⅲ級(jí)(間變性星形細(xì)胞瘤)7例,Ⅳ級(jí)(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)9例;室管膜細(xì)胞瘤的手術(shù)標(biāo)本11例,成活9例,其中室管膜瘤(Ⅱ級(jí))7例,間變性室管膜瘤(Ⅲ級(jí))2例。2.原代培養(yǎng):應(yīng)用物理和化學(xué)方法,成功地培養(yǎng)出星形細(xì)胞瘤和室管膜瘤原代細(xì)胞。腫瘤級(jí)別不同,細(xì)胞的生長(zhǎng)活性不同,其中Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)星形細(xì)胞瘤可以成活并可穩(wěn)定傳代4-6代(約

10、28d),Ⅱ,Ⅲ級(jí)室管膜瘤可以成活且能傳4-5代(約25d)。3.形態(tài)學(xué)觀察:倒置顯微鏡下,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)多樣,大小不一;其中星形細(xì)胞瘤細(xì)胞呈星形、三角形、菱形或梭形。腫瘤級(jí)別越高,細(xì)胞貼壁時(shí)間越短,生長(zhǎng)越旺盛,并呈交錯(cuò)性生長(zhǎng)(細(xì)胞失去極性);室管膜瘤細(xì)胞呈玫瑰花結(jié)狀排列,大小不一,胞質(zhì)豐富,無(wú)分枝狀突起。4.免疫細(xì)胞化學(xué)檢查:原代培養(yǎng)的星形細(xì)胞瘤GFAP呈陽(yáng)性、Ⅳ型膠原CollagenⅣ呈陰性,nestin陽(yáng)性(Ⅳ級(jí)星形細(xì)胞瘤);原代培

11、養(yǎng)的室管膜細(xì)胞瘤GFAP呈陽(yáng)性、CD99陽(yáng)性,EMA陰性。為此,結(jié)合細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)方式及免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果,證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞分別為星形細(xì)胞瘤細(xì)胞和室管膜細(xì)胞瘤細(xì)胞。5.Boyden小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果:原代培養(yǎng)的Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)星形細(xì)胞瘤細(xì)胞,Ⅱ,Ⅲ級(jí)室管膜瘤細(xì)胞隨著體外鈣離子濃度的升高,其穿膜細(xì)胞數(shù)先增高后降低,隨著鎂離子濃度的升高,其穿膜細(xì)胞數(shù)呈降低趨勢(shì)。在侵襲實(shí)驗(yàn)中,在相同的培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)條件下,與Ⅲ級(jí)星形細(xì)胞瘤細(xì)胞相比,Ⅳ級(jí)星形細(xì)胞瘤

12、細(xì)胞不同時(shí)間的穿膜細(xì)胞數(shù)均高于Ⅲ級(jí)星形細(xì)胞瘤細(xì)胞,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與Ⅱ級(jí)室管膜瘤細(xì)胞相比,Ⅲ級(jí)室管膜瘤細(xì)胞不同時(shí)間的穿膜細(xì)胞數(shù)均高于Ⅱ級(jí)室管膜瘤細(xì)胞,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。6.明膠酶譜的凝膠電泳結(jié)果:原代培養(yǎng)的Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)星形細(xì)胞瘤細(xì)胞,Ⅱ,Ⅲ級(jí)室管膜瘤細(xì)胞隨著體外鈣鎂離子離子濃度的不同,出現(xiàn)4到5條透明條帶,分子量為62kD,64kD,72kD,82kD和92kD,分別是MMP-2、MMP-2中介體、p

13、roMMP-2、MMP-9和proMMP-9。隨鈣離子濃度的升高,MMP-2的含量先增高后降低,隨著鎂離子濃度的升高,MMP-2的含量呈降低趨勢(shì)。鈣離子的組別之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),鎂離子的組別之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)
　　結(jié)論：1.采用“機(jī)械分散法+胰酶消化法”的綜合分離法可較好的進(jìn)行星形細(xì)胞瘤和室管膜瘤組織的原代細(xì)胞培養(yǎng),是經(jīng)濟(jì)、有效的膠質(zhì)瘤原代培養(yǎng)的方法。2、原代培養(yǎng)的星形細(xì)胞瘤細(xì)胞的形態(tài)區(qū)別于