組織工程人工肌肉生物學特性的改善及PLG生物支架作為骨骼肌細胞載體的應用研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：組織工程人工肌肉的構建與評價及神經支配特性的改進
　　 目的：體外構建組織工程人工肌肉，并分析組織工程人工肌肉中肌球蛋白重鏈亞型（MHC）表達情況。為進一步提高人工肌肉對神經遞質的敏感性，我們嘗試上調乙酰膽堿受體在人工肌肉表面的數目并誘導人工肌肉形成形態(tài)成熟的乙酰膽堿受體。
　　 方法：將表達綠色熒光蛋白的C3H小鼠原代成肌細胞與120 μl Fibrin 水凝膠混合，體外構建

2、人工肌肉。利用實時定量PCR對平面培養(yǎng)細胞和組織工程人工肌肉中的MHC 亞型進行分析。利用Agrin 蛋白上調乙酰膽堿受體在人工肌肉表面的數目。用Laminin 蛋白在人工肌肉表面誘導形成形態(tài)成熟的乙酰膽堿受體。并用激光共聚焦顯微鏡計數乙酰膽堿受體數目，觀察乙酰膽堿受體形態(tài)。
　　 結果：未經過任何處理的組織工程人工肌肉的MHC 亞型處于胚胎期和成熟期之間，相當于圍周期（perinatal）的發(fā)育水平。平面培養(yǎng)的細胞中MHC 亞

3、型為胚胎期水平。Agrin 蛋白誘導，增加了乙酰膽堿受體在人工肌肉表面的數目。Laminin 蛋白處理，改善了乙酰膽堿受體的結構，形成形態(tài)成熟乙酰膽堿受體。
　　 結論：從發(fā)育學意義上看，人工組織肌肉表達更加成熟的MHC 亞型，更類似成熟肌肉組織。Agrin 蛋白誘導成功增加乙酰膽堿受體數目。Laminin 蛋白誘導,改善了乙酰膽堿受體的結構，使之變得更加成熟有利于更多神經突觸的形成，進一步提高了人工組織肌肉在神經生物學上的結構

4、優(yōu)勢，為在人工肌肉中引入神經分布奠定了基礎。
　　 第二部分：VEGF 改善組織工程人工肌肉周圍血管網絡分布的研究
　　 目的：改善人工組織工程肌肉的生物特性，增加其周圍血管生成，達到增強其與宿主循環(huán)系統營養(yǎng)與代謝交流的目的，使之在移植后更好與宿主整合，長期生存，在宿主體內發(fā)揮作用。
　　 方法：逆轉錄病毒感染成肌細胞，使其分別表達VEGF和GFP。用分化培養(yǎng)液，體外融合表達VEGF和GFP的成肌細胞，以形成雜交

5、人工肌肉。用共聚焦顯微鏡觀察雜交人工肌肉組織形態(tài)和結構，以及移植前后細胞存活率。用免疫酶連反應檢測VEGF含量。用伊文思藍染色評價人工肌肉周圍血管網絡形成情況。
　　 結果：表達VEGF的細胞可在分化條件下分化為成熟肌細胞，并形成肌纖維，肌細胞分化過程不受VEGF 生長因子表達的抑制。用這種細胞在體外成功構建組織工程人工肌肉，結構形態(tài)與生理狀態(tài)下的肌肉相似。VEGF的表達不影響雜交人工肌肉中肌細胞的存活率。調節(jié)雜交比例可調節(jié)VE

6、GF的生成量。移植到小鼠皮下之后，表達VEGF的人工肌肉明顯增加人工肌肉周圍血管網絡的生成，提高肌細胞的存活率。
　　 結論：肌細胞分泌的VEGF可在移植區(qū)域強烈促進局部微血管生成，這種影響可持續(xù)幾個月，為其移植后與宿主整合提供了生理基礎，也有利于肌細胞所表達的治療性蛋白盡可能多進入血液循環(huán)，在宿主體內發(fā)揮有效作用。
　　 第三部分：PLG 生物支架作為骨骼肌細胞載體的研究及NK細胞移除對支架上肌細胞體內存活率的影響

7、r>　　 目的：評價人工合成的可降解生物支架PLG作為成骨骼肌細胞載體的效果，以及去除裸鼠NK細胞對PLG 支架上成熟肌細胞成活率的影響。
　　 方法：利用高壓氣泡法成功制備可降解的多孔PLG 生物支架。將人類原代骨骼成肌細胞接種至PLG 生物支架上，檢測成肌細胞在PLG 支架是否可體外分化為成熟肌細胞。將接種肌細胞的PLG 生物支架移植至免疫缺陷型小鼠體內，觀察肌細胞在體內存活率。利用抗NK細胞抗體去除裸鼠體內NK細胞，檢測

8、去除NK細胞后，PLG生物支架上肌細胞的存活率。
　　 結果：成功制備PLG 生物支架。成肌細胞可在PLG 生物支架上分化為成熟肌細胞。與無張力組相比，PLG 支架顯著提供肌細胞在體存活率。PLG 在移植四周后，PLG生物支架上的肌細胞密度降低了78%。去除裸鼠體內NK細胞的影響，在第4 周，肌纖維中肌細胞的存活率達34.72%，遠高于未去除NK細胞組的存活率22.72%。經過NK細胞抗體處理過的動物肌纖維綠色熒光強度比未經過處