β-TCP多孔生物陶瓷軟骨組織工程支架的研發(fā)及應用研究.pdf

1、【目的】:β-TCP是一種較理想的骨組織工程無機支架材料,傳統(tǒng)的β-TCP生物陶瓷制作方法制作的生物陶瓷,其微結構難以控制,應用于軟骨組織工程的較少。近年來法國地中海大學成功地研制了微孔結構可控的β-磷酸三鈣多孔陶瓷材料,該材料不僅具有良好的生物相容性和較高的機械強度,而且可調控微結構以適合軟骨組織工程構建的需要。我們和上海貝奧路公司合作,通過研究不同微結構的生物陶瓷支架復合軟骨細胞體外培養(yǎng)的結果,發(fā)現適合軟骨組織工程構建的生物陶瓷支架

2、材料微結構。通過對兔解剖結構的測量,建立兔關節(jié)軟骨缺損模型,進行體內生物陶瓷支架軟骨修復動物實驗,觀察并評估軟骨修復效果,從而找到適合體內軟骨組織構建的生物陶瓷支架。為β-TCP材料進一步臨床應用于關節(jié)軟骨缺損的修復提供實驗依據。
　　【方法】:(一)選取二月齡健康新西蘭大白兔,耳緣靜脈注射空氣栓塞處死,取雙側股骨髁、肱骨及脛骨,剔除周圍軟組織,分別使用游標卡尺及64排CT重建進行測量,獲取各項解剖數據。(二)消化分離成年兔肋軟骨

3、細胞及關節(jié)軟骨細胞進行體外培養(yǎng),觀察兩種軟骨細胞的細胞獲得率、存活率、細胞貼壁率、形態(tài)學變化、MTT法測定細胞增殖速度,并且進行甲苯胺蘭染色、亮綠-番紅花“0”染色、二甲基亞甲基藍法測定硫酸糖胺多糖。從而優(yōu)選出適合軟骨組織工程研究的合適的軟骨細胞及其傳代數。(三)通過對肋軟骨細胞復合不同微結構的生物陶瓷材料進行體外培養(yǎng),計算軟骨細胞在支架內增殖生長的不同趨勢,優(yōu)選出適合軟骨細胞生長的β-TCP生物陶瓷支架的合適微結構。(四)利用專利技術

4、,在前期研究的基礎上,燒結出適合軟骨組織工程構建的具有合適微結構的β-TCP生物陶瓷支架材料。(五)將體外實驗優(yōu)選的適合軟骨細胞生長的微結構的β-TCP生物陶瓷支架材料復合肋軟骨細胞植入兔關節(jié)軟骨缺損模型中,以驗證該微結構修復動物體內關節(jié)軟骨缺損的可行性。
　　【結果】:(一)解剖測量的結果得到了兔股骨髁、肱骨及脛骨的各項數據,并且進行了CT三維重建,測量結果顯示肱骨頭軟骨面至骺線距離4.5±0.2mm。脛骨內側平臺寬度為6.1±

5、0.4mm,外側平臺寬度為6.4±0.3mm,但脛骨平臺表面覆蓋有半月板組織,無法進行手術顯露,這兩個部位都無法滿足體內試驗的需要。股骨內側髁寬度為5.0±0.2mm,外側髁寬度為4.0±0.1mm,兩側髁的寬度都較小,并且表面形態(tài)較不規(guī)整,同樣不滿足體內試驗的需要。股骨滑車寬度為6.5±0.5mm,滑車近髁間窩表面軟骨至髓腔距離為9.1±0.6mm,并且表面形態(tài)較規(guī)整,可以適合體內試驗的需要。(二)利用專利技術進行適合軟骨組織工程研究

6、的合適微結構β-TCP生物陶瓷支架材料的燒制,并且進行相關理化性能的表征檢測。(三)兩種軟骨細胞體外培養(yǎng)的結果顯示關節(jié)軟骨:消化時間為6.49±1.87h,細胞獲得率為5.79±1.7×10 5/100mg。肋軟骨:消化時間為4.14±1.45h,細胞獲得率為4.76±1.2×10 5/100mg,肋軟骨細胞和關節(jié)軟骨細胞在細胞獲得率、存活率、貼壁率上都不具有統(tǒng)計學意義,而肋軟骨細胞的消化時間卻低于關節(jié)軟骨細胞,P值為0.0032。二甲

7、基亞甲基藍法測定細胞傳代培養(yǎng)液中GAG的含量,顯示1代軟骨細胞及2代軟骨細胞分泌GAG的量和原代細胞相似無統(tǒng)計學差異,但從第3代軟骨細胞開始則開始具有統(tǒng)計學差異。(四)對軟骨細胞復合不同微結構的支架材料培養(yǎng)的結果顯示,培養(yǎng)第一周,不同內連接徑及孔徑的支架材料中種植的肋軟骨細胞的生長速度無明顯差異,但是從第二周開始,在孔徑相同的條件下內連接徑120μm的支架材料生長速度明顯快于其他內連接徑的支架材料,這種情況一直延續(xù)到第四周。(五)進行體

8、內動物實驗認證,結果證明肋軟骨細胞復合β-TCP生物陶瓷材料可以修復兔關節(jié)軟骨缺損,4月后的2代肋軟骨細胞組組織學評分為20.76±2.13,甲苯氨蘭、番紅及Ⅱ型膠原染色均顯示軟骨組織修復較為完全。
　　【結論】:兔股骨滑車近髁間窩軟骨缺損的動物模型是有效的,適合軟骨細胞組織工程研究。軟骨種子細胞優(yōu)選的結果發(fā)現肋軟骨細胞在體外生長速度較快,分泌糖胺聚糖的量更多,從體外擴增數量的角度出發(fā),2代軟骨細胞較適合軟骨組織工程構建的需要。微

9、結構不同的生物陶瓷支架材料對肋軟骨細胞體外培養(yǎng)的結果是有差異的,孔徑為500-630μm,內連接徑120m的生物陶瓷材料體外培養(yǎng)較適合軟骨細胞體外生長的需要。體內動物實驗的結果發(fā)現,不同的復合方式軟骨修復結果是有差異的。肋軟骨細胞經體外培養(yǎng)至2代后復合生物陶瓷支架材料修復動物關節(jié)軟骨缺損的結果較原代消化細胞直接復合支架材料修復動物關節(jié)軟骨缺損效果為好。硬質生物陶瓷材料完全可以作為軟骨工程的支架材料。硬質支架材料上層軟骨細胞成軟骨,下層軟