土鱉蟲(chóng)纖溶成分的提取和基因克隆的研究.pdf

1、土鱉蟲(chóng)為傳統(tǒng)活血化淤類(lèi)中藥,首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被廣泛用于治療血滯經(jīng)閉、淤血腹痛和因跌打損傷引起的血淤不通等病癥,治療效果顯著。然而迄今,未見(jiàn)到對(duì)土鱉蟲(chóng)抗血栓機(jī)理的深入研究,土鱉蟲(chóng)體內(nèi)的纖溶活性成分也未被完全分離純化出來(lái),這對(duì)充分開(kāi)發(fā)祖國(guó)醫(yī)學(xué)這一寶貴動(dòng)物藥材,研制高效低副作用抗血栓藥物造成了極大困難。本文通過(guò)生化分離手段,從土鱉蟲(chóng)體內(nèi)提取純化出三種具有纖溶活性的物質(zhì),并對(duì)其中一種進(jìn)行了生化性質(zhì)的研究,并在此基礎(chǔ)上深入至分子水平,對(duì)土鱉

2、纖溶活性成分進(jìn)行了基因克隆和分析。
　　本研究中,首先通過(guò)硫酸銨分段沉淀、DEAE-纖維素柱和Sephadex G-75柱層析從活雌性地鱉體內(nèi)分離純化得到一種纖溶酶原激活物(EFF-1),該激活物經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè),顯示為一條帶,其分子量為41.3KD,含糖量為10.5％。其水解纖維蛋白的比活力為547.9U/mg,進(jìn)一步研究表明,該成分屬于絲氨酸蛋白酶類(lèi)。此外,通過(guò)制備電泳法,從活雌性土鱉體內(nèi)分離純化到另外兩種纖溶成分:

3、 EFF-2、EFF-3,分子量分別為32.9KD和30.6KD,比活力為234.0U/mg和148.5U/mg,EFF-2和EFF-3均具有直接纖溶酶活性,提示它們?yōu)樾碌木哂欣w溶酶活性的蛋白酶。
　　其次根據(jù)已登陸NCBI網(wǎng)站的蚯蚓纖溶酶、蜈蚣纖溶激酶和人的激肽釋放酶的氨基酸保守序列設(shè)計(jì)出一對(duì)簡(jiǎn)并引物,用RT-PCR的方法從土鱉體內(nèi)克隆到一段長(zhǎng)度為434bp基因序列,共編碼144個(gè)氨基酸,經(jīng)蛋白質(zhì)Blastp比對(duì),證實(shí)獲得的氨基

4、酸序列為胰蛋白酶家族成員,與多種動(dòng)物的胰蛋白酶有較高的同源性,與蚯蚓纖溶酶、蜈蚣纖溶酶激酶及人類(lèi)激肽釋放酶的蛋白質(zhì)序列有一定的同源性,保守序列也一致,證明所克隆出來(lái)的cDNA序列是土鱉胰蛋白酶的一段核苷酸序列,為首次發(fā)現(xiàn)的基因,記為序列一,命名為ET-I;再跟據(jù)上述蚯蚓纖溶酶、蜈蚣纖溶激酶的成熟肽N端氨基酸保守序列和序列一設(shè)計(jì)出一對(duì)簡(jiǎn)并引物,從土鱉蟲(chóng)體內(nèi)克隆到一段長(zhǎng)度為535bp基因,其氨基酸序列與序列一有81%的一致性,為另一種胰蛋白

5、酶家族成員,同樣與多種動(dòng)物的胰蛋白酶有較高的同源性。根據(jù)序列二,運(yùn)用3'末端快速擴(kuò)增法(3'RACE)法成功克隆出序列二的3'端序列,記為序列三。將序列二和序列三進(jìn)行拼接,得出完整成熟肽,記為序列四,命名為ET-II。ET-II共815bp,含Poly(A)序列。終止子為T(mén)AA。ET-II成熟肽共編碼224個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)其成熟肽分子量為24640Da。將ET-II氨基酸序列遞交NCBI進(jìn)行Blastp比對(duì),結(jié)果顯示其為胰蛋白酶類(lèi)絲氨酸蛋

6、白酶,與蜜蜂絲氨酸蛋白酶、德國(guó)小蠊胰蛋白酶有很高的同源性,與蜈蚣纖溶酶激酶、人纖溶系統(tǒng)相關(guān)的激肽釋放酶和粉正蚓纖溶酶、赤子愛(ài)勝蚓纖溶酶酶等也有一定的同源性。至此,本實(shí)驗(yàn)獲得了兩段基因,一段為中間序列,另一段為含3'末端的成熟肽完整序列,這兩段基因翻譯而成的蛋白是否有纖溶活性還需在獲得全長(zhǎng)基因后表達(dá)鑒定才能確定。
　　土鱉蟲(chóng)為傳統(tǒng)活血破淤的中藥,動(dòng)物試驗(yàn)證明土鱉蟲(chóng)粗提物具有溶解靜脈血栓,抑制血小板聚集,抗凝血的作用。本文運(yùn)用生化方法