維生素E琥珀酸酯誘導(dǎo)黑色素瘤B16細(xì)胞分化的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:通過體外實(shí)驗(yàn)研究維生素E琥珀酸酯(Vitamin E succinate,VES;α-tocopheryl succinate,α-TOS)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞周期和相關(guān)蛋白表達(dá)以及黑色素小體改變的影響并進(jìn)一步探討VES抑制黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制,從而為黑色素瘤治療提供新的方法及相應(yīng)的理論依據(jù)。
　　 方法:體外培養(yǎng)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞,采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)不同濃度VES作用于B16細(xì)胞2

2、4h、48h、72h后對(duì)其增殖抑制情況及經(jīng)瑞-吉染色后光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化并篩選出適合的藥物濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測(cè)定VES對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞作用48h后的細(xì)胞周期分布和凋亡率;應(yīng)用透射電鏡觀察黑色素小體;NaOH裂解法測(cè)定黑色素含量變化;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VES處理B16細(xì)胞48小時(shí)后細(xì)胞周期蛋白cyclinD1和P21蛋白的表達(dá)變化;免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)各組腫瘤細(xì)胞cyclinD1和P21蛋白表達(dá)情況。

3、從而初步探討VES對(duì)B16細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用及相應(yīng)機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1 VES抑制B16細(xì)胞增殖:
　　 MTT法結(jié)果顯示,5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml VES處理細(xì)胞24～72h后,各處理組OD值均有不同程度下降,與對(duì)照組相比,有顯著性差異(P＜0.01),各實(shí)驗(yàn)組間比較,亦有顯著性差異(P＜0.01)。且隨藥物濃度的增大、作用時(shí)間的延長(zhǎng),VES各組OD值逐漸下降,抑制率升高,即VES

4、對(duì)B16細(xì)胞的增殖抑制作用呈明顯的時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)。
　　 2 VES可誘導(dǎo)B16細(xì)胞周期阻滯和凋亡:
　　 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,5、10、20μg/ml VES作用于B16細(xì)胞48h后,隨藥物濃度增加,G0/G1期細(xì)胞比例增加,S期比例下降,增殖指數(shù)PI明顯下降(P＜0.01),證明VES可阻滯B16細(xì)胞周期進(jìn)程于G0/G1期,且該作用呈劑量依賴性。VES各劑量組凋亡率分別為0.42±14％、0.72±0.18％

5、、1.06±0.72％。對(duì)照組凋亡率為0.25±0.04％。因凋亡率均低于5％,且無亞二倍體凋亡峰出現(xiàn),故在5-20μg/mlVES作用于B16細(xì)胞后,無凋亡出現(xiàn),證明在此范圍內(nèi)VES不能誘導(dǎo)鼠黑色素瘤B16細(xì)胞凋亡。
　　 3 VES對(duì)B16細(xì)胞形態(tài)的影響及電鏡觀察黑色素小體:
　　 經(jīng)瑞-吉染色后光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn):正常的黑色素瘤B16細(xì)胞呈貼壁、多層生長(zhǎng),形態(tài)為圓形、橢圓形或多邊形,生長(zhǎng)不規(guī)則。而VES作用于B

6、16細(xì)胞后,細(xì)胞呈一定的極性生長(zhǎng),平行排列,不重疊,隨著時(shí)間延長(zhǎng),多數(shù)細(xì)胞體積變大,延長(zhǎng),細(xì)胞呈網(wǎng)狀排列,具有樹突狀結(jié)構(gòu),生長(zhǎng)緩慢,細(xì)胞數(shù)明顯變少,此形態(tài)變化于作用48h后較為明顯。
　　 電鏡結(jié)果顯示:在未經(jīng)VES處理過的B16細(xì)胞中,胞膜完整,表面有較多微絨毛,細(xì)胞核大,圓形,核漿比較大,常染色質(zhì)豐富,異染色質(zhì)較少,胞質(zhì)內(nèi)可見游離核糖體,其他細(xì)胞器少,未見典型的黑色素小體;然而,經(jīng)VES(10、20μg/ml)作用后,胞膜表

7、面微絨毛較少,細(xì)胞核變小,核內(nèi)異染色質(zhì)增多,核漿比變小,細(xì)胞器豐富,可見大量典型的黑色素小體,未見凋亡形態(tài)的細(xì)胞,這與以上凋亡率的檢測(cè)結(jié)果一致。
　　 4黑色素含量的測(cè)定:
　　 黑色素瘤細(xì)胞與正常黑色素細(xì)胞相比,黑色素合成能力低下。當(dāng)被分化誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化時(shí),黑色素生成能力明顯增加,有效的分化誘導(dǎo)作用應(yīng)使黑色素含量增加2倍以上。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,5μg/ml,10μg/ml,20μg/ml的VES作用于B16細(xì)胞48h后,

8、黑色素含量與對(duì)照組比較,分別是對(duì)照組的1.006±0.2410倍,1.813±0.4380倍,3.654±0.7000倍。經(jīng)統(tǒng)計(jì),10μg/ml,20μg/ml組較未加藥組有極顯著性差異(P＜0.01),其中20μg/ml濃度組是對(duì)照組黑色素含量的3.654±0.7000倍＞2倍,故20μg/ml VES有效地誘導(dǎo)了B16細(xì)胞的分化。
　　 5流式細(xì)胞儀檢測(cè)B16細(xì)胞cyclinD1、P21蛋白表達(dá):
　　 5、10、2

9、0μg/ml VES作用于B16細(xì)胞48h后,發(fā)現(xiàn)cyclinD1蛋白的熒光指數(shù)(FI)隨VES濃度增大而逐漸減少,P21蛋白的FI值則隨藥物濃度的增大而逐漸增大。對(duì)于每一種蛋白,其處理組和對(duì)照組FI值比較,均有極顯著性差異(P＜0.01)。
　　 6免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞cyclinD1、P21蛋白表達(dá)并進(jìn)行評(píng)分:
　　 未加藥組,cyclinD1蛋白在鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的細(xì)胞漿和核均有表達(dá),以胞漿為主,強(qiáng)度成強(qiáng)

10、陽性;VES處理后,隨著VES濃度增加,蛋白在核、漿表達(dá)均逐漸減少,以核減少為主;評(píng)分統(tǒng)計(jì)后VES各組cyclinD1蛋白表達(dá)值隨VES濃度增加而逐漸減小。未加藥組,P21蛋白在鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的細(xì)胞漿和核極少量表達(dá),強(qiáng)度較弱;VES處理后,隨著VES濃度的增加,蛋白在核漿表達(dá)逐漸增加,以核增加為主;評(píng)分統(tǒng)計(jì)后P21蛋白表達(dá)值隨VES濃度增加而逐漸增大。兩種蛋白各自比較,VES處理組和陰性對(duì)照組,均有顯著性差異(P＜0.01)。

11、r>　　 結(jié)論:
　　 1、在不表現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的劑量范圍內(nèi),VES可明顯抑制黑色素瘤B16細(xì)胞增殖,并呈劑量-時(shí)間依賴性。
　　 2、VES可通過對(duì)黑色素瘤細(xì)胞周期阻滯誘導(dǎo)分化,將細(xì)胞阻滯于G0/G1期,該作用呈劑量依賴性,并以48小時(shí)作用最明顯。
　　 3、VES對(duì)B16細(xì)胞有較強(qiáng)的分化誘導(dǎo)能力,形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢,細(xì)胞連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),電鏡可見VES處理過的B16細(xì)胞內(nèi)含大量典型黑色素小體。功能上表現(xiàn)