HRM法在糞便DNA篩查大腸癌中的應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　 1.探討糞便APC、K-ras和P53基因突變檢測對大腸癌分期及預(yù)后的判斷價值。
　　 2.探討糞便APC、K-ras和P53基因突變檢測在大腸癌篩查中的價值。
　　 3.初步評價HRM法在糞便DNA篩查大腸癌中的應(yīng)用價值。
　　 方法：
　　 選取2009.3～2009.9在惠州市中心人民醫(yī)院胃腸外科及消化內(nèi)科住院的大腸癌患者39例，大腸腺瘤患者28例，選取同期正常對照26例。研究

2、組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)腸鏡或外科手術(shù)獲取標(biāo)本，并經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為大腸腺瘤或大腸癌患者；(2)如大腸癌和大腸腺瘤共存，納入大腸癌組。研究組排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)家族性腺瘤性息肉病或遺傳性非息肉性大腸癌；(2)合并其他系統(tǒng)或器官惡性腫瘤；(3)大腸癌或大腸腺瘤患者同時患有炎癥性腸??；(4)大腸癌手術(shù)切除前有放療或化療史；(5)非原發(fā)癌灶者及不能確診的患者。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡、性別匹配；(2)行全結(jié)腸鏡檢查陰性；(3)無其他系統(tǒng)或器官惡

3、性腫瘤。收集研究對象腸鏡檢查前或手術(shù)前的新鮮糞便標(biāo)本約1g，所有糞便標(biāo)本收集后立即保存于-80℃冰箱。本研究經(jīng)惠州市中心人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。糞便DNA的提取按QIAamp DNA stool mini kit(Qiagen)說明書操作，提取的DNA保存在-20℃冰箱。使用HRM法檢測糞便中APC、K-ras和P53基因突變的情況。然后對HRM檢測陽性的標(biāo)本進(jìn)行直接測序證實糞便DNA中APC、K-ras和P53基

4、因堿基突變的具體情況。實驗結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。基因頻率采用直接計數(shù)法，各組間率的比較采用x2檢驗和Fisher'S精確概率法。檢驗水準(zhǔn)取α=0.05，P<0.05差別有統(tǒng)計學(xué)意義
　　 結(jié)果：
　　 1.大腸癌患者糞便中APC、K-ras和P53基因突變與臨床病理參數(shù)的關(guān)系
　　 1.1糞便中APC、K-ras和P53基因突變率與大腸癌患者性別無關(guān)：糞便APC基因在男性和女性中的突變率分別為52

5、.38％(11/21)和61.11％(11/18)(x2=0.30P>0.05)；糞便K-ras基因在男性和女性中的突變率分別為42.86％(9/21)和27.78％(5/18)(x2=0.96 P>0.05)；糞便P53基因在男性和女性中的突變率分別為66.67％(14/21)和55.56％(10/18)(x2=0.5119>0.05)。
　　 1.2糞便中APC、K-ras和P53基因突變率與大腸癌患者年齡無關(guān)：糞便APC基

6、因在≥50歲和<50歲患者中的突變率分別為51.61％(16/31)和75.00％(6/8)(x2=0.62P>0.05)；糞便K-ras基因在≥50歲和<50歲患者中的突變率分別為32.26％(10/31)和50.00％(4/8)(x2=0.27 P>0.05)；糞便P53基因在≥50歲和<50歲患者中的突變率分別為58.06％(18/31)和75.00％(6/8)(x2=0.02 P>0.05)。
　　 1.3糞便中APC、

7、K-ras和P53基因突變率與大腸癌分化狀態(tài)無關(guān)：糞便APC基因在高中分化腺癌和低分化腺癌患者中的突變率分別為56.76％(21/37)和50.00％(1/2)(P=-0.50)；糞便K-ras基因在高中分化腺癌和低分化腺癌患者中的突變率分別為35.14％(13/37)和50.00％(1/2)(P=0.47)；糞便P53基因在高中分化腺癌和低分化腺癌患者中的突變率分別為62.16％(23/37)和50.00％(1/2)(P=-0.49)

8、。
　　 1.4糞便中APC、K-ras和P53基因突變率與大腸癌病變部位無關(guān)：糞便APC基因在左半結(jié)腸癌和右半結(jié)腸癌患者中的突變率分別為56.76％(21/37)和50.00％(1/2)(P=0.50)；糞便K-ras基因在左半結(jié)腸痛和右半結(jié)腸癌患者中的突變率分別為35.14％(13/37)和50.00％(1/2)(P=-0.47)；糞便P53基因在左半結(jié)腸癌和右半結(jié)腸癌患者中的突變率分別64.86％(24/37)和0.00％

9、(0/2)(P=-0.14)；糞便APC基因在直腸癌和結(jié)腸癌患者中的突變率分別為53.85％(14/26)和61.54％(8/13)(x2=0.21P>0.05)；糞便K-ras基因在直腸癌和結(jié)腸癌患者中的突變率分別為34.62％(9/26)和38.46％(5/13)(x2=0.06 P>0.05)；糞便P53基因在直腸癌和結(jié)腸癌患者中的突變率分別為53.85％(14/26)和76.92％(10/13)(x2=1.10 P>0.05)。

10、
　　 1.5糞便中APC、K-ras和P53基因突變率與大腸癌Dukes分期無關(guān)：糞便APC基因在Dukes A、B期和Dukes C、D期患者中的突變率分別為57.89％(11/19)和55.00％(11/20)(x2=0.03 P>0.05)；糞便K-ras基因在DukesA、B期和DukesC、D期患者中的突變率分別為36.84％(7/19)和35.00％(7/20)(x2=0.01 P>0.05)；糞便P53基因在Du

11、kesA、B期和DukesC、D期患者中的突變率分別為52.63％(10/19)和70.00％(14/20)(x2=1.24 P>0.05)。
　　 1.6糞便中APC、K-ras和P53基因突變率與大腸癌有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)：糞便APC基因在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的突變率分別為55.00％(11/20)和57.89％(11/19)(x2=0.03 P>0.05)；糞便K-ras基因在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的突

12、變率分別為35.00％(7/20)和36.84％(7/19)(X2=0.01P>0.05)；糞便P53基因在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的突變率分別為70.00％(14/20)和52.63％(10/19)(x2=1.24 P>0.05)。
　　 2.大腸癌、大腸腺瘤和正常人糞便中APC、K-ras和p53基因突變的比較
　　 2.1糞便APC基因突變率在大腸癌組、大腸腺瘤組和對照組中分別為56.41％(22/39)、

13、25.00％(7/28)和3.85％(1/26)，大腸癌組和大腸腺瘤組糞便APC基因突變率均高于對照組(P=-0.01，P=0.03)，且大腸癌組高于大腸腺瘤組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=6.55 P<0.05)。以全結(jié)腸鏡檢查加病理組織學(xué)檢查為大腸癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。糞便APC基因篩查大腸癌的靈敏度為56.41％(22/39)，特異度為85.19％(46/54)。
　　 2.2糞便K.ras基因突變率在大腸癌組、大腸腺瘤組和對照組中

14、分別為35.90％(14/39)、14.29％(4/28)和0％，大腸癌組糞便K-ras基因突變率高于對照組(P=-0.01)，大腸腺瘤組和對照組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=-0.06)，且大腸癌組和大腸腺瘤組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(x2=2.85 P>0.05)。以全結(jié)腸鏡檢查加病理組織學(xué)檢查為大腸癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。糞便K-ras基因篩查大腸癌的靈敏度為35.90％(14/39)，特異度為92.59％(50/54)。
　　 2.3糞便

15、P53基因突變率在大腸癌組、大腸腺瘤組和對照組中分別61.54％(24/39)、50.00％(14/28)和3.85％(1/26)，大腸癌組和大腸腺瘤組糞便：P53基因突變率均高于對照組(P=0.01，P=-0.01)，而大腸癌組和大腸腺瘤組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(x2=0.48 P>0.05)。以全結(jié)腸鏡檢查加病理組織學(xué)檢查為大腸癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。糞便P53基因篩查大腸癌的靈敏度為61.54％(24/39)，特異度為72.22％(39/54

16、)。
　　 2.4大腸癌組三個基因聯(lián)合檢出率為66.67％(26/39)，大腸腺瘤組三個基因聯(lián)合檢出率為64.29％(18/28)，對照組三個基因聯(lián)合檢出率為3.85％(1/26)，大腸癌組和大腸腺瘤組均高于對照組(P=0.01，P=0.01)，而大腸癌組和大腸腺瘤組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(x2=0.04 P>0.05)。
　　 3.HRM法在糞便DNA篩查大腸癌中的應(yīng)用評價
　　 3.1應(yīng)用HRM法在39例大腸癌

17、患者糞便中檢出APC基因突變22例，經(jīng)測序均發(fā)現(xiàn)有基因突變，兩者的一致率為100％(22/22)。
　　 3.2應(yīng)用HRM法在39例大腸癌患者糞便中檢出K-ras基因突變14例，經(jīng)測序均發(fā)現(xiàn)有基因突變，兩者的一致率為100％(14/14)。
　　 3.3應(yīng)用HRM法在39例大腸癌患者糞便中檢出P53基因突變24例，經(jīng)測序均發(fā)現(xiàn)有基因突變，兩者的一致率為100％(24/24)。
　　 結(jié)論：
　　 1.未發(fā)

18、現(xiàn)糞便APC、K-ras和P53基因突變情況與大腸癌患者的臨床病理參數(shù)具有相關(guān)性。
　　 2.大腸癌患者糞便APC、K-ras和P53基因突變率高于大腸腺瘤患者，正常人糞便APC、K-ras和P53基因極少發(fā)生突變。
　　 3.大腸癌患者糞便單基因突變檢測篩查大腸癌的靈敏度較低，多個基因聯(lián)合檢測能提高大腸癌篩查的靈敏度。
　　 4.HRM法與基因測序的一致率較高，提示HRM法檢測糞便DNA突變篩查大腸癌具有潛在臨