TGFβ1基因codon10基因多態(tài)性對(duì)肝臟細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的：肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤致死原因中位列第三。肝炎病毒、黃曲霉毒素、酒精、飲水污染和遺傳因素都是肝細(xì)胞癌的主要病因，其中最重要的一個(gè)病因是乙肝病毒(hepatitis Bvirus，HBV)或丙肝病毒(hepatitis C virus，HCV)的慢性感染。慢性乙型肝炎(chronichepatitis B，CHB)是一種最常見的高發(fā)病率和高死亡率的

2、傳染性肝病。全球乙肝病毒感染者約有20億，其中乙肝病毒攜帶者約為3.5億，每年大約有一百萬人死于HBV感染繼發(fā)的肝衰竭、肝硬化和肝癌。我國(guó)是乙肝的高發(fā)地，據(jù)流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，HBsAg陽性者占總?cè)丝诘?.18％，約1.2億人。其中慢性乙型肝炎患者約2000-3000萬人。作為乙肝主要不良結(jié)局的肝纖維化/硬化和原發(fā)性肝癌同樣具有較高的發(fā)病率，以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度沉積為特征的肝纖維化是急、

3、慢性肝病的主要病理轉(zhuǎn)歸，且早期具有可逆性，但如果得不到及時(shí)診斷和治療，就可進(jìn)一步發(fā)展成為肝硬化，肝功能可從代償走向失代償，患者最終因肝功能衰竭或并發(fā)肝癌而影響生存。
　　 肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝臟的間質(zhì)細(xì)胞，在慢性肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用。最新研究表明肝星狀細(xì)胞可以作為抗原提呈細(xì)胞，表達(dá)多種抗原提呈相關(guān)的重要分子，在肝臟相關(guān)的免疫功能中也發(fā)揮重要的作用。
　　

4、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factorβ1，TGFβ1)是強(qiáng)效致纖維化因子，介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)組織的損傷，在纖維硬化性疾病中能激活纖維形成細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生，改變基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)及其抑制劑的活性，增強(qiáng)靶細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)性，對(duì)肝炎、肝損傷后肝纖維化、肝硬化具有重要起始促進(jìn)作用。TGFβ1至少存在10個(gè)以上的單核苷酸多態(tài)性(single nucleo

5、tide polymorphism，SNP)位點(diǎn)，-509位點(diǎn)位于TGFβ1啟動(dòng)子區(qū)域，codon10(Leu＞Pro)存在于TGFβ1前體分子的信號(hào)肽中，而信號(hào)肽中氨基酸序列的改變理論上可影響相應(yīng)蛋白質(zhì)的分泌。我們?cè)O(shè)計(jì)相應(yīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)八種肝臟細(xì)胞系的TGFβ1基因-509位點(diǎn)的基因型及針對(duì)codon10(Leu＞Pro)的SNP對(duì)肝臟相關(guān)細(xì)胞功能的影響進(jìn)行研究。
　　 方法：用PCR-RFLP方法檢測(cè)八種肝臟細(xì)胞系的TGFβ1基因

6、-509位點(diǎn)的基因型。構(gòu)建含codon10(Leu＞Pro)的TGFβ1(LAP+成熟態(tài)單體)真核表達(dá)重組體CMV-Leu、CMV-Pro。在L02、HepG2、SMMC-7721、LX-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體、CMV-Leu、CMV-Pro，培養(yǎng)24小時(shí)后，ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清TGFβ1量。L02和HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染三種質(zhì)粒后進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第12、24、36、48小時(shí)，分別進(jìn)行MTF實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞增殖

7、情況的影響；L02和HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后48小時(shí)，用Annexin V和PI進(jìn)行雙染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染三種質(zhì)粒后培養(yǎng)24小時(shí)，用CD105-FITC抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD105分子的表達(dá)情況。LX-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染三種質(zhì)粒后培養(yǎng)24小時(shí)，用CD80-FITC、CD83-PC5、CD1α-PE熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行避光孵育，流式細(xì)胞儀檢測(cè)三種CD分子的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.0(Sta

8、tistical Package forthe SocialScience11.0)統(tǒng)計(jì)軟件用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：確定了八種肝臟細(xì)胞系的TGFβ1基因-509位點(diǎn)和codon10的基因型。構(gòu)建的含codon10(Leu＞Pro)的TGFβ1(LAP+成熟態(tài)單體)真核表達(dá)重組體CMV-Leu、CMV-Pro通過測(cè)序確認(rèn)序列正確。在四種細(xì)胞系中，分別轉(zhuǎn)染CMV-Leu、CMV-Pro組的TGFβ1分泌量比pc

9、DNA3.1組高，證明CMV-Leu、CMV-Pro能成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞并能對(duì)其產(chǎn)生作用，提高其TGFβ1分泌量。轉(zhuǎn)染CMV-Pro組細(xì)胞的TGFβ1分泌量比轉(zhuǎn)染CMV-Leu組高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在L02細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染CMV-Leu、CMV-Pro的凋亡率比轉(zhuǎn)染pcDNA3.1的凋亡率低，其中轉(zhuǎn)染CMV-Pro的凋亡率又低于轉(zhuǎn)染CMV-Leu的凋亡率，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。在HepG2細(xì)胞的凋亡實(shí)驗(yàn)中可以

10、發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染CMV-Leu組和CMV-Pro組的細(xì)胞凋亡率顯著高于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組的凋亡率(P＜0.01)，其中轉(zhuǎn)染CMV-Leu組的細(xì)胞凋亡率又顯著高于轉(zhuǎn)染CMV-Pro組的凋亡率(P＜0.01)。在L02和HepG2細(xì)胞的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，兩種細(xì)胞轉(zhuǎn)染CMV-Pro組的細(xì)胞增殖活性都高于相應(yīng)的CMV-Leu轉(zhuǎn)染組。在HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1、CMV-Leu、CMV-Pro后，轉(zhuǎn)染CMV-Pro組CD105表達(dá)率比轉(zhuǎn)染CM

11、V-Leu組高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在LX-2實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染CMV-Leu、CMV-Pro細(xì)胞的CD1α、CD80表達(dá)率并無明顯差異，轉(zhuǎn)染CMV-Pro組的CD83表達(dá)率明顯低于轉(zhuǎn)染CMV-Leu組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：TGFβ1基因codon10為Pro時(shí)比為L(zhǎng)eu時(shí)更能促進(jìn)細(xì)胞TGFβ1的分泌活性，并能增加HepG2細(xì)胞的CD105表達(dá)。TGF p1 codon10為Pro時(shí)比為L(zhǎng)eu時(shí)更能