類風濕性關節(jié)炎中重要信號轉導通路阻斷劑的制備及其功能研究.pdf

1、盤狀結構域受體(discoidin domain receptors，DDRs)屬于一種受體型蛋白酪氨酸激酶，蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases，PTKs)是一大類介導細胞增殖或凋亡的相關信號轉導分子。DDRs分子不僅與細胞增殖相關，還與細胞過分泌MMPs相關。它參與了許多細胞生理進程，如細胞增殖、分化、遷移和代謝，尤其是在控制軟骨細胞增殖和骨骼生長中發(fā)揮重要作用。DDR2是類風濕性關節(jié)炎(rheumato

2、id arthritis，RA)病理進程中起重要作用的分子之一。在RA滑膜細胞中，DDR2呈高表達狀態(tài)，并具有較高的的磷酸化水平。它被膠原活化，介導基質金屬蛋白酶(matrix metallo- proteinases，MMPs)的表達，MMPs作用于關節(jié)軟骨，最終造成關節(jié)軟骨不可逆的破壞。因此，本研究制備了Ⅱ型膠原-DDR2-MMPs這一信號通路的阻斷劑，使其阻斷DDR2介導的MMPs持續(xù)分泌，期望將來為臨床上治療RA提供新的候選藥物

3、。本研究主要取得了以下結果： 1．成功構建了DDRs/IgG融和表達載體，并在HEK293細胞和CHO細胞中進行了表達鑒定。本實驗對DDR2的DS domain與IgG的Fc段進行了融合表達，DS domain是DDRs結合其配體——Ⅱ型膠原的有效區(qū)域，之所以將它和Fc段進行融合，目的是利用Fc的二硫鍵使DDR2 DS domain形成二聚體，使其具備與Ⅱ型膠原結合的構象，通過競爭性結合Ⅱ型膠原而抑制它與天然受體結合，進而阻斷Ⅱ

4、型膠原-DR2-MMPs這一信號通路。 2．利用CHO細胞表達系統(tǒng)，通過穩(wěn)定轉染和壓力篩選，獲得了強表達DDR2/Fc融合蛋白的單克隆細胞株。 3．通過大量培養(yǎng)陽性細胞株，收集培養(yǎng)上清后，利用蛋白A親和層析，對融合蛋白進行回收與純化，結果表明蛋白表達量在1.14 μ g/mL (7.98 μ g/10<'7>cell)。 4．經(jīng)過競爭性結合抑制實驗和細胞實驗，證明制備出的競爭性阻斷劑——DDR2/Fc融合蛋白在體