醋甲唑胺對蛛網(wǎng)膜下腔出血小鼠神經(jīng)功能損害及神經(jīng)元凋亡的影響.pdf

1、研究目的：
　　1、通過神經(jīng)病學(xué)評分及曠場試驗，探討醋甲唑胺對SAH小鼠的感覺運動及認(rèn)知功能的影響。
　　2、通過FJB染色及TUNEL法檢測出血側(cè)腦皮層及海馬的變性和凋亡神經(jīng)元的變化，探討醋甲唑胺對SAH小鼠神經(jīng)元凋亡的影響。
　　3、通過免疫組織化學(xué)和western blot檢測醋甲唑胺對SAH后凋亡關(guān)鍵分子caspase-3蛋白的影響，初步探討醋甲唑胺處理影響SAH后神經(jīng)元凋亡的分子機制。
　　研究方法：<

2、br>　　1．小鼠SAH模型的建立及分組
　　雄性C57BL/6J小鼠（25-30g）隨機分為假手術(shù)組、未用藥組及醋甲唑胺組。用血管內(nèi)插線法建立小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，激光多普勒血流儀記錄血流量的變化。假手術(shù)組穿刺過程僅感到阻力但不穿破血管。醋甲唑胺組術(shù)后30分鐘開始腹腔注射醋甲唑胺（20mg/kg），以后每12小時注射一次，一般用藥至處死的各時相點，最長不超過72小時。其余兩組在相同時相注射等量的PBS。
　　2.蛛網(wǎng)膜下

3、腔出血程度的判定
　　對本實驗所有需術(shù)后24小時處死的小鼠進(jìn)行出血評分。術(shù)后24h處死小鼠并快速取腦，照相機拍攝腦基底池部出血情況，根據(jù)Sugawara等報道的方法進(jìn)行出血等級判定。
　　3．神經(jīng)功能損害評分
　　假手術(shù)組選5只小鼠作為對照，其余每組隨機抽取9只進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評分及曠場試驗。神經(jīng)功能評價采用Garcia評分系統(tǒng)，總分為5—18分。
　　4.認(rèn)知功能評價
　　分別在術(shù)后第3d、7d、14d進(jìn)行

4、曠場試驗。每次試驗記錄小鼠在曠場內(nèi)5 min的行為表現(xiàn)，統(tǒng)計分析其運動總距離及中央格時間。
　　5.腦水腫的檢測
　　假手術(shù)組選5只小鼠作為對照，其余每組隨機抽取9只，SAH后24h，麻醉后斷頭處死取腦，迅速秤重，隨后放置在烤爐內(nèi)，100℃烘烤24小時，再秤重。以公式計算含水量：(濕重一干重)／濕重×100％。
　　6.腦血管痙攣的檢測
　　每組隨機抽取8只小鼠。手術(shù)后24h處死小鼠，采用印度墨水/明膠灌注固定腦

5、血管，照相后用Image J軟件進(jìn)行腦血管直徑的檢測及比較。
　　7．FJB及TUNEL法檢測神經(jīng)元的變性和凋亡
　　每組隨機抽取9只小鼠，手術(shù)后24h，中性多聚甲醛行腦血管灌注后取腦，固定后石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片后FJB法檢測大腦皮層及海馬區(qū)變性壞死神經(jīng)元的比例；TUNEL法檢測大腦皮層及海馬細(xì)胞凋亡的變化。
　　8.免疫組織化學(xué)方法檢測大腦皮層及海馬區(qū)的活化型caspase-3的表達(dá)及分布情況。
　　9. W

6、estern blot法檢測腦組織caspase-3蛋白的表達(dá)，用ImageJ軟件進(jìn)行半定量分析。
　　10.所有實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計學(xué)方法采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，取P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　1. SAH總死亡率為25.3%，其中假手術(shù)組無死亡，未用藥組26.1%，醋甲唑胺組24.4%，未用藥組與醋甲唑胺組死亡率無統(tǒng)計學(xué)差

7、異(p＞0.05)
　　2.出血程度方面，假手術(shù)組無出血；未用藥組的蛛網(wǎng)膜下腔出血評分為8.50±2.17，醋甲唑胺組為8.09±1.81，兩組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。腦血流量方面，未用藥組和醋甲唑胺組手術(shù)過程中各時間點無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。
　　3.神經(jīng)病學(xué)評分，假手術(shù)組24h、48h、72h分別為17.5±0.55、18、18，未用藥組分別為10.33±2.55、12.56±2.13、14.11±2.2

8、6，醋甲唑胺組分別為12.67±2.00、14.67±1.66、16.00±1.00，三組組間各時間點比較均有統(tǒng)計學(xué)差異。24h、48h、72h醋甲唑胺組好于未用藥組小鼠(P　　4.假手術(shù)組3d、7d及14d的曠場試驗運動總距離及中央格時間與未用藥組及醋甲唑胺組比較，有統(tǒng)計學(xué)差異。醋甲唑胺組各時間點的運動總距離及中央格時間較未用藥組改善明顯（p＜0.05）；
　　5.在出血側(cè)大腦半球，醋甲唑胺組腦含水量(77

9、.78%±0.43%)較未用藥組腦含水量(78.27%±0.48%)減少(P<0.05)；
　　6.三組的大腦前及頸內(nèi)動脈直徑比較均無統(tǒng)計學(xué)差異。未用藥組(87.11±6.73)及醋甲唑胺組(89.39±7.22)的大腦中動脈直徑較假手術(shù)組的大腦中動脈直徑(106.89±8.66)明顯變小(PO.05)；
　　7.假手術(shù)組偶見FJB陽性細(xì)胞，醋甲唑胺組出

10、血側(cè)腦皮層及海馬區(qū)FJB陽性細(xì)胞數(shù)(40×)分別為30.89±7.08、16.33±7.77，與未用藥組(42.64±11.58、31.55±4.95)比較明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；
　　8.假手術(shù)組偶見TUNEL陽性細(xì)胞，醋甲唑胺組出血側(cè)腦皮層及海馬區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞(40×)比值分別為12.14%±8.33%、10.42%±12.92%，與未用藥組(25.84%±9.66%、23.60±7.22%)比較明顯

11、降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；
　　9.假手術(shù)組偶見caspase-3免疫陽性表達(dá)于胞漿；醋甲唑胺組出血側(cè)腦皮層及海馬區(qū)caspase-3陽性細(xì)胞(40×)比值分別為20.64%±10.93%、23.67%±9.77%，與未用藥組(44.57%±8.50%、41.96%±16.90%)比較明顯降低，差異統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；
　　10.免疫蛋白印跡結(jié)果顯示，假手術(shù)組無 caspase-3表達(dá)（0.751±0.

12、001），未用藥組caspase-3表達(dá)明顯（0.916±0.089），醋甲唑胺組caspase-3表達(dá)為0.758±0.007，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.醋甲唑胺可減輕SAH后的腦水腫，抑制腦皮層和海馬神經(jīng)元的變性凋亡，早期可改善SAH小鼠的神經(jīng)功能，遠(yuǎn)期可改善SAH小鼠的認(rèn)知功能。
　　2.醋甲唑胺可能通過抑制凋亡關(guān)鍵分子caspase-3的活化表達(dá)，抑制神經(jīng)元的凋亡，從而對SAH后的腦損