整合素β4基因變異及表達(dá)缺陷與哮喘易感性相關(guān)分析.pdf

1、目的：整合素（integrins）是一類普遍存在于細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白。支氣管上皮細(xì)胞構(gòu)成氣道的上皮屏障，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的維持，依賴于細(xì)胞表達(dá)的整合素分子與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白形成異源粘附，將細(xì)胞“錨定”于基膜上。同時(shí)，在氣道高反應(yīng)或氣道炎癥發(fā)生過(guò)程中，部分整合素亞單位及其配體還參與了炎癥細(xì)胞的移行和活化，使氣道結(jié)構(gòu)和完整性遭到破壞，氣道上皮剝脫。本室的前期研究已證實(shí)哮喘患者多個(gè)粘附分子表達(dá)異常，其中integrinβ4在所有哮喘病人檢測(cè)樣本中

2、均表達(dá)下調(diào)。那么，integrinβ4的表達(dá)失平衡在哮喘易感人群中是否具有普遍性；它的異常表達(dá)機(jī)制是什么；integrinβ4的表達(dá)失平衡與哮喘的發(fā)生發(fā)展過(guò)程是否具有密切關(guān)系。本課題將圍繞這一研究目的，通過(guò)哮喘實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和臨床診斷哮喘患者這兩方面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來(lái)開(kāi)展研究。 方法：一、建立哮喘動(dòng)物模型，檢測(cè)integrinβ4表達(dá)與哮喘的相關(guān)性。 1.SPF級(jí)SD大鼠12只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為哮喘組（n=6），對(duì)照組（n=6）

3、。其中哮喘組分別于第1天、第13天經(jīng)腹腔注射10％OVA和10％氫氧化鋁混合液1ml，14 d后用1％ OVA溶液霧化吸入誘喘，每天1次，每次30min，連續(xù)7d。對(duì)照組用等量生理鹽水代替。 2.利用小動(dòng)物呼吸機(jī)和Buxco小動(dòng)物呼吸功能分析系統(tǒng)，測(cè)定氣道阻力和動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性； 3.收集肺泡灌洗液中細(xì)胞，涂片吉姆薩染色后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類。 4.無(wú)菌條件下取肺組織，進(jìn)行肺組織切片檢查。 5.肺組織切片免疫組

4、化觀察Integrinβ4在對(duì)照組和正常組支氣管上皮細(xì)胞、基底細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)變化。 6.Trizol提取肺組織中RNA，Real-time PCR反應(yīng)觀察Integrinβ4在對(duì)照組和正常組表達(dá)變化。 二、臨床哮喘患者integrinβ4表達(dá)與哮喘的相關(guān)性及機(jī)制探討 1.Trizol抽提哮喘患者外周血白細(xì)胞RNA，隨機(jī)引物將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后設(shè)計(jì)特異性的引物和熒光探針（TaqMan

5、探針），進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)integrinβ4表達(dá)。 2.提取哮喘患者外周血白細(xì)胞DNA，應(yīng)用PCR法擴(kuò)增哮喘患者外周血白細(xì)胞integrinβ4基因5’調(diào)控區(qū)，進(jìn)行正反雙向測(cè)序及序列變異分析。 結(jié)果：一、Integrinβ4在哮喘動(dòng)物模型中的表達(dá)與哮喘的相關(guān)性 1、哮喘模型組激發(fā)前后氣道阻力RL增加的百分比和動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性Cdyn降低的百分比均為對(duì)照組的2倍左右。 2、哮喘模型組細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性細(xì)胞、

6、中性粒細(xì)胞比例均高于正常對(duì)照組。 3、哮喘模型組大鼠存在明顯支氣管收縮征象及周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，小血管周圍、肺泡腔、肺間質(zhì)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，并可見(jiàn)支氣管上皮細(xì)胞脫落，肺動(dòng)靜脈周圍水腫及呼吸性細(xì)支氣管阻塞。正常對(duì)照組無(wú)此變化。以上結(jié)果證實(shí)哮喘動(dòng)物模型的成功建立。 4、免疫組化顯示Integrinβ4在支氣管上皮細(xì)胞、基底細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞均有較高表達(dá)，在哮喘模型大鼠中表達(dá)下降。 5、Real-time P

7、CR反應(yīng)測(cè)定哮喘模型大鼠Integrinβ4表達(dá)下調(diào)。 二、臨床哮喘患者integrinβ4表達(dá)與哮喘的相關(guān)性及機(jī)制探討 1、Real-time PCR檢測(cè)顯示Integrinβ4 mRNA在哮喘患者外周血白細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。 2、哮喘患者外周血白細(xì)胞Integrinβ45’調(diào)控區(qū)基因序列存在變異。哮喘患者的-nt1029、-nt1051由G突變?yōu)锳，-nt1151由T突變?yōu)镚，-nt1164由G突變?yōu)镃，提示哮喘