新工藝金芪降糖片對鏈脲佐菌素?fù)p傷大鼠胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究新工藝金芪降糖片對鏈脲佐菌素(STZ)損傷大鼠胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用,并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 方法:本實驗總體設(shè)計分為三個部分,按實驗對象劃分為:大體動物實驗、原代胰島β細(xì)胞實驗與INS-1細(xì)胞株實驗。
　　 1.大體動物實驗:取健康雄性SD大鼠48只,體重180±10g,適應(yīng)性喂養(yǎng)3日后,隨機(jī)分為6組,每組8只,分別為:正常對照組(C)、模型對照組(S)、新工藝金芪降糖片高、中、低劑量組(H、M、L

2、)和陽性藥對照組(G)。其中C、S組按10ml/kg連續(xù)30日ig給予蒸餾水;H、M、L組按3.6g生藥/kg、1.8g生藥/kg和0.9g生藥/kg連續(xù)30日ig給予新工藝金芪降糖片混懸液;G組按1.5mg/kg連續(xù)30日ig給予格列本脲。除C組外,其余各組于給藥后第4日至第10日連續(xù)7日pi給予2.5mg/kg鏈脲佐菌素(STZ),對胰島β細(xì)胞進(jìn)行特異性損傷。C組pi給予5ml/kg的0.9％NaCl作為對照。每3日監(jiān)測各組動物日均

3、飲水量、體重、血清胰島素含量及血糖值。于給藥第30日處死動物,取胰腺組織標(biāo)本測量NO、MDA和SOD含量,并制作石蠟切片進(jìn)行HE染色和免疫組化染色觀察組織形態(tài)的改變和凋亡相關(guān)基因Bcl-2與Bax的蛋白表達(dá)。
　　 2.原代胰島β細(xì)胞實驗:取健康雄性SD大鼠,采用Ficoll400密度梯度離心法分離純化得到原代胰島β細(xì)胞。適應(yīng)性培養(yǎng)24h后接種于96孔板,貼壁后取單層培養(yǎng)細(xì)胞,隨機(jī)分為6組,分別為:正常對照組(C)、模型對照組(

4、S)、新工藝金芪降糖片高、中、低劑量組(H、M、L)和陽性藥對照組(G)。其中H、M、L組按1mg生藥/ml、0.1mg生藥/ml和0.01mg生藥/ml終濃度給予新工藝金芪降糖片培養(yǎng)基溶液;G組按0.5mg/ml終濃度給予格列本脲培養(yǎng)基溶液。除C組外,其余各組均按0.3mg/ml終濃度向培養(yǎng)基內(nèi)加入鏈脲佐菌素(STZ)對胰島p細(xì)胞進(jìn)行損傷。37℃,5％CO2條件下同步培養(yǎng)24h后,通過胰島素釋放試驗與MTT試驗檢測胰島素分泌功能與胰島

5、β細(xì)胞生長活力。
　　 3.INS-1細(xì)胞株實驗:①將INS-1細(xì)胞接種于96孔板常規(guī)培養(yǎng),待貼壁后同上法分組給藥,37℃,5％CO2條件下同步培養(yǎng),每日換液。于給藥后第1,2,3,4,5,6日進(jìn)行MTT試驗檢測細(xì)胞活力,繪制細(xì)胞生長曲線。②用事先鋪好玻片的24孔板制作細(xì)胞爬片,同法分組給藥加以培養(yǎng),72h后,進(jìn)行Hoechst33342染色與AO-PI染色,觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。③同法分組,于100ml培養(yǎng)瓶中按上述所列終

6、濃度加藥培養(yǎng)INS-1細(xì)胞,72h后收集細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。④RT-PCR檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2與Bax的mRNA表達(dá)。⑤Western-Blot檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2與Bax的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.大體動物實驗:①新工藝金芪降糖片高、中劑量組(H、M)在pi給予STZ后,相對于正常對照組(C)日均飲水量逐漸增加(P＜0.05),體重逐漸下降(P＜0.05),但相對于模型對照組(S)

7、變化幅度較輕(P＜0.05),在持續(xù)ig給予新工藝金芪降糖片后癥狀得到控制與改善。②新工藝金芪降糖片高、中劑量組(H、M)在pi給予STZ后,相對于正常對照組(C)血清胰島素含量逐漸下降(P＜0.05),血糖值逐漸增加(P＜0.05),但與模型對照組(S)比較變化幅度相對較小(P＜0.05),在持續(xù)ig給予新工藝金芪降糖片后血清胰島素含量逐步平穩(wěn),血糖值明顯下降。③新工藝金芪降糖片高、中劑量組(H、M)胰腺組織NO、MDA水平顯著低于模

8、型對照組(S)(P＜0.05),SOD水平顯著高于模型對照組(S)(P＜0.05)。④HE染色顯示:新工藝金芪降糖片高、中劑量組(H、M)胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)相對完整,胰島β細(xì)胞數(shù)量較多。⑤免疫組化結(jié)果分析顯示:新工藝金芪降糖片高劑量組(H)較模型對照組(S)胰島形態(tài)有所改觀,Bcl-2和Bax染色積分光密度(IOD)均有明顯不同(P＜0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)較高,Bax蛋白表達(dá)較低。
　　 2.原代胰島β細(xì)胞實驗:①相對于模型對

9、照組(S),新工藝金芪降糖片高劑量組(H)與陽性藥對照組(G)24h胰島素分泌量較高(P＜0.05)。胰島素釋放試驗顯示:新工藝金芪降糖片高劑量組(H)胰島素釋放指數(shù)(IS)明顯高于模型對照組(S)(P＜0.05)。②與模型對照組(S)比較,新工藝金芪降糖片高劑量組(H)的細(xì)胞活力(A490mm)值較高(P＜0.05)。
　　 3.INS-1細(xì)胞株實驗:①新工藝金芪降糖片高、中劑量組(H、M)細(xì)胞增殖作用相對明顯,且呈現(xiàn)劑量依賴

10、關(guān)系。②Hoechst33342染色與AO-PI染色顯示:新工藝金芪降糖片高、中劑量組(H、M)較模型對照組(S)均有不同情況改觀,凋亡和壞死細(xì)胞數(shù)量相對較少。③流式細(xì)胞術(shù)檢測報告顯示:新工藝金芪降糖片高、中、低劑量組(H、M、L)凋亡率均低于模型對照組(S)。④RT-PCR結(jié)果顯示:與模型對照組(S)比較,新工藝金芪降糖片高、中劑量組(H、M)Bcl-2基因mRNA呈現(xiàn)高表達(dá)(P＜0.05),Bax基因mRNA表達(dá)中,模型對照組(S)

11、較其它各給藥組上調(diào)作用更加明顯(P＜0.05)。⑤Western-Blot結(jié)果顯示:與模型對照組(S)比較,新工藝金芪降糖片高、中、低劑量組(H、M、L)Bcl-2基因蛋白均呈現(xiàn)高表達(dá)(P＜0.05),而只有新工藝金芪降糖片高劑量組(H)Bax基因蛋白表達(dá)明顯低于模型對照組(S)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.實驗證實新工藝金芪降糖片對胰島β細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用,主要表現(xiàn)在:
　　 (1)新工藝金芪

12、降糖片能有效改善STZ損傷大鼠胰島細(xì)胞所導(dǎo)致的飲水量增加與體重減輕等糖尿病癥狀,作用較格列苯脲更加持久。
　　 (2)新工藝金芪降糖片能減少STZ對胰島細(xì)胞分泌功能的破壞,使機(jī)體保持一定的血清胰島素含量,從而有效控制血糖。
　　 (3)新工藝金芪降糖片能夠抑制胰腺組織中NO等活性氧簇(ROS)的形成,從而減少MDA等脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生,同時還可提高SOD水平,更好地清除氧自由基,保護(hù)胰島細(xì)胞。
　　 (4)新工藝

13、金芪降糖片能保護(hù)胰島正常生理結(jié)構(gòu),并減輕STZ對大體動物胰島細(xì)胞內(nèi)Bcl-2基因蛋白表達(dá)的下調(diào)和Bax基因蛋白表達(dá)的上調(diào)作用。
　　 (5)新工藝金芪降糖片能夠增強(qiáng)STZ環(huán)境下大鼠原代胰島細(xì)胞的生長活力,保護(hù)其胰島素分泌功能。
　　 (6)新工藝金芪降糖片能夠促進(jìn)STZ損傷條件下INS-1胰島細(xì)胞的增殖活動,且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。
　　 (7)新工藝金芪降糖片能夠有效抑制STZ誘導(dǎo)的INS-1胰島細(xì)胞凋亡率,減少細(xì)