牛羊混合膽汁中有效成分的提取純化及GCA在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究.pdf

1、本文在實(shí)驗(yàn)室提取純化牛羊混合膽汁中有效成分工藝的基礎(chǔ)上，通過改進(jìn)和完善工藝、擴(kuò)大試驗(yàn)規(guī)模，建立了一套穩(wěn)定、可靠的從牛羊混合膽汁中提取分離天然?；撬帷⒛懰?、甘氨膽酸及牛磺膽酸的小試工藝技術(shù)路線，并對(duì)提取過程中廢棄的的原料及試劑進(jìn)行了回收套用研究，同時(shí)開展了有效成分甘氨膽酸在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究。旨在為下一步開展從牛羊混合膽汁中提取有效成分的中試實(shí)驗(yàn)研究奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)，為牛羊膽汁的綜合開發(fā)利用提供可靠的理論依據(jù)和可能性，同時(shí)為闡明甘氨膽酸

2、在大鼠血清及組織中的分布和變化規(guī)律，開發(fā)臟器生化藥物新資源提供線索。 提取?；撬岬男≡嚬に囇芯坎捎妹摰鞍?、除色素、堿解酸化等方法開展了從牛羊混合膽汁中提取天然?；撬岬男≡嚬に囇芯俊２捎眉垖游龇ê图t外光譜掃描法對(duì)提取物進(jìn)行定性檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果證明提取樣品與牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)品顯色斑點(diǎn)Rf值相同，紅外光譜特征吸收峰一致，表明提取出的樣品為牛磺酸；采用薄層掃描法測(cè)定其含量，結(jié)果證明其純度平均達(dá)98.6％；測(cè)定了方法回收率，結(jié)果表明?；撬崽崛×科?/p>

3、均達(dá)13.1g/L，回收率平均達(dá)86.7％，這與實(shí)驗(yàn)室工藝提取?；撬岬慕Y(jié)果一致，表明該提取工藝穩(wěn)定、可靠。提取膽酸、甘氨膽酸、牛磺膽酸的小試工藝研究采用脫蛋白、除色素、萃取、柱層析分離等方法開展了從牛羊混合膽汁中分離、提取和純化膽酸、甘氨膽酸及?；悄懰崛N有效成分的小試提取工藝研究。采用正交試驗(yàn)篩選了柱層析最佳條件，以容積為10L的層析柱進(jìn)行分離純化，固定相為硅膠，流動(dòng)相為氯仿和正丁醇混合溶劑，一次裝樣量3000mL膽汁，流動(dòng)相采用梯度

4、洗脫，先按4：1比例分離膽酸和甘氨膽酸，然后按3：2比例分離甘氨膽酸和?；悄懰?，流動(dòng)相洗脫速度為3～5mL/s。采用薄層層析法和紅外光譜掃描法對(duì)提取物進(jìn)行定性檢測(cè)，結(jié)果證明三種提取樣品分別與膽酸、甘氨膽酸及?；悄懰針?biāo)準(zhǔn)品顯色斑點(diǎn)Rf值相同，紅外光譜特征吸收峰均一致，表明提取出的三種樣品分別為膽酸、甘氨膽酸、牛磺膽酸結(jié)晶體。采用薄層掃描法測(cè)定其含量，結(jié)果證明三種成分平均純度分別達(dá)98.0％、98.4％、98.6％。首次測(cè)定了方法回收率，結(jié)

5、果顯示三種成分提取量平均分別達(dá)11.0g/L、9.1g/L、9.3g/L，回收率平均達(dá)64.4％、63.7％、67.8％，這與實(shí)驗(yàn)室工藝提取三種有效成分結(jié)果一致，表明小試提取工藝穩(wěn)定、可行。采用留樣觀察法研究了不同批次的三種有效成分在室溫環(huán)境和4℃封閉避光環(huán)境下的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，三種白色粉末樣品在室溫環(huán)境中均不穩(wěn)定，易受潮變質(zhì)，在4℃封閉避光環(huán)境下均具有較高的穩(wěn)定性，不易變質(zhì)。廢舊原料、試劑的回收套用研究采用精餾法回收了提取工藝中的廢

6、舊乙醇，試驗(yàn)結(jié)果表明回收乙醇純度平均達(dá)95％以上，符合提取工藝純度要求：采用堿洗、酸洗及去離子水洗滌等方法對(duì)廢舊硅膠進(jìn)行了回收，結(jié)果表明回收硅膠物理性狀與新硅膠無差異，pH值相同；將回收乙醇和硅膠重新套用到提取工藝中，結(jié)果證明提取效果與新乙醇、硅膠提取效果無顯著差異，表明使用回收乙醇和硅膠不影響對(duì)四種有效成分的提取效果，可以重復(fù)利用。甘氨膽酸在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究采用固相萃取—反相高效液相色譜法測(cè)定了大鼠血清及肝、腎、腦組織中甘氨膽

7、酸的含量。結(jié)果表明，在0.15625～10.0μg/ml范圍內(nèi)血清中甘氨膽酸濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程Y=39579X+57823，R2=0. 9984；以信噪比S/N=3為標(biāo)準(zhǔn)，最低檢測(cè)濃度為0.021μg/ml；平均回收率為98.49％；日內(nèi)RSD為0.52％～2.00％，日間RSD為0.74％～4.98％；穩(wěn)定性試驗(yàn)第一組的平均含量為99.35％，RSD為2.24％，第二組的平均含量為100. 87％，RSD為4.73

8、％：測(cè)定了肝、腎、腦組織中甘氨膽酸含量，采用體外甘氨膽酸標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法計(jì)算了相應(yīng)的組織濃度，其結(jié)果僅反映組織中甘氨膽酸濃度的相對(duì)變化規(guī)律，不能體現(xiàn)真正的組織濃度值，但對(duì)組織樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行了較細(xì)致的考察，其結(jié)果和血樣結(jié)果基本一致。該方法具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、實(shí)用的特點(diǎn)，適用于甘氨膽酸含量的分析。采用固相萃取一反相高效液相色譜法測(cè)定了給藥后不同時(shí)間血清及肝、腎、腦組織中甘氨膽酸的濃度。結(jié)果顯示：（1）在血清中符合一級(jí)吸收二室模型

9、，藥動(dòng)學(xué)方程：C= 41.17e-1.256t+84.7 e—0.491t-125.87e—0.667t。（2）在肝臟中符合一級(jí)吸收一室模型，藥動(dòng)學(xué)方程：C=18.734（e—0.042t—e—0.733t）。（3）在腎臟中符合一級(jí)吸收一室模型，藥動(dòng)學(xué)方程：C=105.88（e—0.076t．e—0.081t）。（4）在腦組織中符合一級(jí)吸收一室模型，藥動(dòng)學(xué)方程：C=5.312（e—o．082t—e 0.098t）。結(jié)果表明，甘氨膽酸口服