IP-10 SiRNA對血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響及其對血管再狹窄的防治作用.pdf

1、研究背景:
　　 血管再狹窄是限制血管成形術(shù)遠(yuǎn)期療效的主要原因，是一系列復(fù)雜的病理生理過程聯(lián)合作用的結(jié)果，以血管平滑肌細(xì)胞擴(kuò)增、遷移為主要病理特征。研究表明，IP-10可能具有潛在的促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞擴(kuò)增和遷移的作用，在動(dòng)脈粥樣硬化形成的過程中，血管壁細(xì)胞IP-10的高表達(dá)在活化T細(xì)胞的募集和定植中發(fā)揮了作用，粥樣斑塊的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均有IP-10的高表達(dá)。在同種異體移植物的血管病變中，IP-10的高表達(dá)促進(jìn)了以

2、免疫介導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞擴(kuò)增為特征的血管病變的發(fā)生。針對血管再狹窄的病理基礎(chǔ)，本研究試圖將IP-10作為新的靶點(diǎn)，運(yùn)用具有高效、高特異性的RNA干擾技術(shù)，沉默其在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)，研究其在血管平滑肌細(xì)胞擴(kuò)增過程中發(fā)揮的作用，并進(jìn)一步研究其在體內(nèi)血管再狹窄復(fù)雜過程中發(fā)揮的作用。
　　 目的:
　　 研究RNA干擾技術(shù)沉默IFN-γ誘導(dǎo)蛋白10(IP-10)基因后對血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響，探討IP-10在血管損傷后內(nèi)膜過

3、度增生過程中發(fā)揮的作用。
　　 方法:
　　 1、根據(jù)GeneBank報(bào)道的IP-10核酸序列和SiRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)并合成針對IP-10的2條小干擾RNA，構(gòu)建針對IP-10的SiRNA表達(dá)質(zhì)粒pSilence 2.0-U6，并進(jìn)行酶切鑒定和測序；
　　 2、原代培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞，將構(gòu)建好的IP-10SiRNA真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入原代培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞中，RT-PCR及Western blot檢測細(xì)胞IP-10表

4、達(dá)，MTT法檢測細(xì)胞增殖速率；
　　 3、球囊擴(kuò)張加高膽固醇飲食構(gòu)建新西蘭兔左頸總動(dòng)脈內(nèi)膜損傷模型，將IP-10 SiRNA局部轉(zhuǎn)染入損傷血管，分別于轉(zhuǎn)染后1周和4周末取標(biāo)本，RT-PCR和免疫組化檢測IP-10表達(dá)；HE染色觀察血管形態(tài)，比較血管內(nèi)膜中膜比；電子顯微鏡觀察血管內(nèi)膜增生狀態(tài)。
　　 結(jié)果:
　　 1、酶切結(jié)果顯示重組質(zhì)粒插入片段大小與預(yù)期相符，測序結(jié)果證實(shí)該重組質(zhì)粒序列與所設(shè)計(jì)序列完全一致，表明針

5、對IP-10的SiRNA真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 2、IP-10 SiRNA轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，細(xì)胞IP-10表達(dá)與未轉(zhuǎn)染組比較明顯降低，細(xì)胞生長速度減慢(P＜0.05)。
　　 3、兔頸總動(dòng)脈轉(zhuǎn)染IP-10SiRNA一周和四周后，IP-10局部表達(dá)較未轉(zhuǎn)染組明顯降低。4周時(shí)，轉(zhuǎn)染組血管內(nèi)膜中膜比較未轉(zhuǎn)染組減少(P＜0.01)，同時(shí)，電子顯微鏡下，干擾組內(nèi)膜結(jié)構(gòu)較未轉(zhuǎn)染組規(guī)則、平整，增生較輕。
　　 結(jié)論:

6、>　　 1、設(shè)計(jì)、合成了一個(gè)針對IP-10的特異性RNA干擾核苷酸序列，成功構(gòu)建了針對IP-10基因的SiRNA真核表達(dá)載體。
　　 2、SiRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染可有效抑制內(nèi)源性基因表達(dá)，本研究中質(zhì)粒pSilencer2.0-U6-siIP-10轉(zhuǎn)染可有效抑制IP-10mRNA和蛋白水平表達(dá)，并抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖。
　　 3、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)局部轉(zhuǎn)染pSilencer2.0-U6-siIP-10成功抑制了IP-10的表