咖啡酸苯乙酯對血管平滑肌細胞增殖的影響及其對動脈內(nèi)膜損傷后血管再狹窄的防治作用及機制.pdf

1、第一部分
　　 CAPE 對培養(yǎng)的血管平滑肌細胞生長的影響
　　 目的:觀察不同濃度的咖啡酸苯乙酯 (caffeic acid phenethyl ester CAPE)對脂多糖(lipopolyccharide LPS)激活的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)生長情況的影響。
　　 方法：DMEM 細胞培養(yǎng)基中加入不同濃度藥物為試驗組，不加者為對照組。用MTT

2、比色法描述不同濃度LPS作用VSMCs 72h 內(nèi)的生長情況，及CAPE 對一定濃度LPS (1mg﹒L-1)激活VSMCs 120h的影響；通過平板克隆實驗觀察LPS和CAPE作用3周對細胞增殖的影響；細胞免疫化學法用于檢測CAPE作用72小時后VSMCs 表達PCNA 情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、不同濃度LPS 對VSMCs 生長的影響 0.1-10 mg﹒L-1 LPS 實驗組O.D 值較對照組明顯升高，表明一

3、定濃度范圍內(nèi)的LPS 能增強VSMCs 增殖。5.10.20.40.80 mg﹒L-1 CAPE作用VSMCs (1mg﹒L-1 LPS 刺激)后具有顯著抑制細胞的增殖作用，且呈時間和劑量效依賴關(guān)系。
　　 2、平板克隆實驗一定濃度范圍的LPS作用于VSMCs3周可明顯增加細胞克隆的形成，而CAPE 明顯抑制細胞克隆的形成。CAPE 濃度越高，形成的克隆數(shù)就越少；
　　 3、CAPE 對VSMCs 中PCNA蛋白表達的影

4、響 PCNA蛋白陽性反應(yīng)定位在細胞核或核膜，呈棕黃色或棕褐色。VSMCs 經(jīng)0-10 mg﹒L-1 LPS 刺激時，各實驗組PCNA 逐漸增高，與對照組比較有顯著差異；經(jīng)不同濃度CAPE處理后，PCNA 陽性率由對照組的91.8[％]±1.7[％]逐漸降低為最高CAPE 濃度組的40.0[％]±1.8[％](p<0.01)。
　　 4、藥物溶劑DMSO 對VSMCs 增殖沒有顯著影響。
　　 結(jié)論：通過MTT 試驗，細胞

5、克隆形成試驗以及PCNA蛋白檢測試驗，發(fā)現(xiàn)LPS作為刺激因子可顯著激活VSMCs體外培養(yǎng)時的生長，在一定濃度范圍內(nèi)與LPS的劑量呈以來關(guān)系。同時試驗還發(fā)現(xiàn)作為干預(yù)因素，CAPE 可顯著抑制LPS 激活的VSMCs的生長，并與藥物的作用時間和劑量相關(guān)。試驗顯示CAPE 抑制細胞生長與PCNA 陽性表達率降低有關(guān)，提示抑制細胞周期相關(guān)蛋白的表達可能是其作用機制之一。
　　 第二部分CAPE 影響培養(yǎng)的VSMCs 生長的機制
　

6、　 目的:探討不同濃度的CAPE 抑制激活的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)生長情況的機制。
　　 方法：采用ELISA 法檢測細胞培養(yǎng)基上清液中IL-6，TNF-α等細胞因子。流式細胞儀檢測CAPE 對VSMCs 細胞周期的變化和凋亡的影響；采用凝膠遷移或電泳遷移率檢測法(electrophoretic mobility shift assays，EMSA)檢測核轉(zhuǎn)錄因子

7、-κ B (nuclear factor ofkappa B，NF-κ B)在平滑肌細胞中的活性；實時定量PCR 技術(shù)用于檢測細胞中Sur(survivin，存活素)，Bcl-2 及Bax 表達水平的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、LPS 導(dǎo)致細胞培養(yǎng)液中IL-6，TNF-α皆有升高，并且隨著LPS 濃度的增加IL-6，TNF-α
　　 的濃度升高；同時隨著LPS 刺激時間的延長，細胞因子的濃度也升高。而CAPE

8、 對有一定濃度刺激的VSMCs 產(chǎn)生的IL-6，TNF-α有抑制作用，其抑制效果與CAPE的濃度和作用時間有關(guān)。
　　 2、細胞周期分析表明5-20mg﹒L-1 CAPE處理VSMCs 24 h 后，對照組實驗組G0/G1 期細胞百分率明顯升高；S 期細胞百分率由對照組的32.4[％]±2.6[％]逐漸下降20 mg/L組的11.2[％]±1.4[％]，呈劑量依賴性(p<0.05)。
　　 3、流式細胞儀發(fā)現(xiàn)5-20 m

9、g﹒L-1 CAPE作用VSMCs 24h 后，細胞的凋亡率分別為(10.1％±0.7[％]，18.9[％]±1.3[％]，27.3[％]±2.4[％])顯著高于對照組(4.2[％]±0.3[％])(P<0.05)，且凋亡細胞隨CAPE 劑量的增加逐漸增多。
　　 4、EMSA 實驗發(fā)現(xiàn)LPS 使平滑肌細胞中NF-κ B 活性增加，而CAPE 則可顯著抑制其活性。
　　 5、不同濃度LPS和CAPE 對細胞表達mRNA的

10、影響相反。LPS 增加細胞在表達抗凋亡的相關(guān)mRNA，同時抑制促進凋亡的相關(guān)mRNA 表達。而CAPE的作用則相反。 CAPE各組細胞表達Bax mRNA 水平升高，Sur和Bcl-2 mRNA 表達水平與對照組比較明顯下降。
　　 結(jié)論：CAPE 使處于G0/G1 期的細胞增加S 期的減少同時CAPE 促進細胞凋亡；ELISA和EMSA 試驗表明CAPE 對細胞因子的影響；同時CAPE 還使細胞表達抗凋亡基因降低，促凋亡基因表

11、達增加。這些證據(jù)表明一定劑量范圍的CAPE 可能是通過調(diào)節(jié)細胞周期，影響細胞釋放細胞因子，干預(yù)NF-κ B 活性以及細胞凋亡相關(guān)基因的表達等多個機制和手段抑制體外培養(yǎng)的VSMCs 增殖的。
　　 第三部分CAPE 對大鼠頸總動脈球囊擴張術(shù)后內(nèi)膜增生的影響及其機制
　　 目的：為探索RS的發(fā)病機制并進行干預(yù)研究，我們模擬復(fù)制大鼠頸總動脈內(nèi)膜損傷后不同時間點的VSMCs 增殖和血管重塑動態(tài)變化模型，并探討CPAE 對血管內(nèi)皮

12、損傷誘發(fā)的VSMCs 增殖的抑制作用及對活體大鼠表達Sur，Bax，Bcl-2 等凋亡相關(guān)基因的影響。
　　 方法：建立雄性SD大白鼠(體重300～350g)頸動脈損傷的動物模型，動物隨機分為：假損傷組(sham-injured group，S組)、損傷組 (injured group，I組)和損傷+CAPE 治療組 (injured+20 mg kg-1 CAPE-treated group，CAPE組)。采用HE 染色法彈力

13、顯微染色法檢測3、7、14、28d 血管形態(tài)學改變，計算機圖像分析系統(tǒng)檢測新生內(nèi)膜厚度(H)，新生內(nèi)膜面積(NIA)，中膜面積(MA)，內(nèi)彈力板圍繞面積(IEM)、外彈力板圍繞面積(EEM)、各組血管腔面積 (lumen area，LA)并計算新生內(nèi)膜面積/中膜面積(NIA/MA)、管腔狹窄指數(shù)(NIA/IEM)；免疫組織化學SABC 法檢測I組和CAPE組血管壁細胞中Sur、Bax和Bcl-2蛋白的表達，計算機圖像分析蛋白表達的平均光

14、密度值。TUNEL 法檢測細胞凋亡率。ELISA 法檢測血清中IL-6，TNF-α等細胞因子。EMSA實驗用于檢測血管壁細胞中NF-κ B 活性。實時定量PCR檢測血管壁Sur，Bax 及Bcl-2mRNA的表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 1、S組大鼠總動脈內(nèi)膜僅見單層內(nèi)皮細胞；I組球囊損傷后3d 血管腔內(nèi)表面可見增殖的VSMCs，14d 內(nèi)新生內(nèi)膜(neointima，NI)形成并厚度增加，同時細胞外基質(zhì)(extrac

15、ellular matrix，ECM)也逐漸增加。 14d 時中膜面積明顯大于未損傷血管。LA14d 以后明顯小于未損傷側(cè)。損傷后 3～7 d NIA/MA，NIA/IEM 至14 d 達最大。CAPE組各項指標與I組比較有相反的變化趨勢。
　　 2、S組血管壁組織細胞中的Sur，Bcl-2和Bax蛋白表達水平相對較低。I組的Sur蛋白水平術(shù)后14天內(nèi)持續(xù)升高，在28天時發(fā)現(xiàn)其表達水平較第14天降低；Bcl-2蛋白表達水平一直升

16、高；Bax蛋白術(shù)后也升高，7d 后開始下降。CAPE組Sur，Bcl-2蛋白水平較I組降低，但Bax蛋白較I組升高。
　　 3、S組血管TUNEL 染色未見陽性著色；球囊損傷后TUNEL 陽性細胞先增多后減少。CAPE 使細胞凋亡率增加，其作用隨時間的延長而加強。
　　 4、S組術(shù)后IL-6和TNF-α逐漸升高。I組細胞因子血清比S組顯著升高，與S組相比差異顯著(P<0.01)；CAPE組術(shù)后6h 血清TNF-α含量與I

17、組相比顯著降低(P<0.01)
　　 5、EMSA 實驗發(fā)現(xiàn)S組血管組織中未見NF-κ B 活性，I組中NF-κ B 活性在48h 內(nèi)持續(xù)升高，之后開始下降至損傷即可水平而CAPE 則可顯著抑制其活性。
　　 6、實時定量RT-PCR 表明S組血管壁組織細胞中的Sur，Bcl-2和Bax mRNA 表達水平相對較低。I組中mRNA的變化趨勢與其蛋白表達的變化相似。CAPE組Sur，Bcl-2 mRNA水平較I組降低，但B