HOXA10在髓系白血病細(xì)胞NB4中的表達(dá)及藥物對其干預(yù)作用.pdf

1、 目的：觀察同源盒基因A10(homeobox gene A10,HOXA10)在人急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)細(xì)胞系NB4細(xì)胞中的表達(dá)及全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)的干預(yù)對其表達(dá)的影響,通過mRNA水平和蛋白水平研究HOXA10表達(dá)的變化趨勢,探討HOXA10介導(dǎo)白血病發(fā)生的機(jī)制并為臨床應(yīng)用ATRA治療白血病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：1. 采用NB4細(xì)胞

2、株作為髓系白血病細(xì)胞模型,并用腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)。2. 采用 CCK-8 (Cell Counting Kit-8)法分別檢測不同濃度的ATRA在不同干預(yù)時(shí)間對 NB4 細(xì)胞增殖的影響,進(jìn)而確定實(shí)驗(yàn)最終所采取的藥物濃度以及檢測的時(shí)間點(diǎn)。3. 實(shí)驗(yàn)分組：取對數(shù)生長期細(xì)胞106/ml,本課題共設(shè)四個(gè)組,其中實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為1.0μmol/L的ARTA干預(yù)4h、48h、96h,對照組不加藥物干預(yù)。4. 采用瑞氏染色法鑒定NB4細(xì)胞

3、并觀察經(jīng)ATRA誘導(dǎo)后,隨著時(shí)間的推移NB4細(xì)胞發(fā)生的形態(tài)學(xué)變化。5. 采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 法( real-time fluorescent quantitative-PCR,FQ-RT-PCR)檢測NB4細(xì)胞中HOXA10 mRNA的表達(dá)水平及ATRA干預(yù)對其表達(dá)的影響。6. 采用Western bolt法檢測HOXA10 蛋白的表達(dá)及藥物干預(yù)后的變化。7. 免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemical techni

4、que,IHC)定性定位檢測HOXA10蛋白在NB4細(xì)胞中的表達(dá)部位及藥物干預(yù)對蛋白表達(dá)強(qiáng)弱的影響。8. 統(tǒng)計(jì)方法：所有數(shù)據(jù)資料均行方差齊性檢驗(yàn),并用 SPSS11.5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05則差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1. CCK-8試驗(yàn)結(jié)果確定本實(shí)驗(yàn)所采取的藥物終濃度為1.0μmol/L,檢測時(shí)間點(diǎn)為ATRA干預(yù)細(xì)胞后4h、48h和96h。2. 瑞氏染色結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的細(xì)胞為幼稚粒細(xì)胞,且經(jīng)1.0μmol/L ATRA誘

5、導(dǎo)后發(fā)生形態(tài)學(xué)上的細(xì)胞分化現(xiàn)象,在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察可見細(xì)胞核明顯縮小,核可偏向一側(cè),有分葉狀、折疊、凹陷等現(xiàn)象出現(xiàn),胞漿量增多,核質(zhì)比變小,核仁減少或消失。3. HOXA10基因在NB4細(xì)胞中高表達(dá),且在ATRA干預(yù)細(xì)胞 4h、48h 和 96h 后基因表達(dá)呈下降趨勢,其中 48h 和 96h HOXA10 mRNA表達(dá)量較對照組明顯降低(P<0.05)。4. NB4細(xì)胞中可以檢測到HOXA10蛋白的表達(dá),且隨著ATRA干預(yù)時(shí)間的延

6、長, HOXA10蛋白的表達(dá)量逐漸降低,其中4h組下降不明顯(P>0.05),而48h與96h組HOXA10蛋白表達(dá)量有顯著地降低(P<0.05)。5. NB4細(xì)胞中有HOXA10蛋白的表達(dá)主要位于NB4細(xì)胞的胞膜和胞漿,并在 ATRA 干預(yù)后蛋白的表達(dá)強(qiáng)度逐漸減弱。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)證明HOXA10基因和蛋白在人急性髓系白血病細(xì)胞株NB4的細(xì)胞增殖過程中有表達(dá),1.0μmol/L ATRA在誘導(dǎo)時(shí)間內(nèi)能促進(jìn)NB4細(xì)胞向成熟方向分化,并能下調(diào)