Mtb Ag85B199-207、HIV-1Env120-128特異TCRs基因共修飾CD8+T細(xì)胞及其活性研究.pdf

1、背景及目的：結(jié)核菌/艾滋病病毒雙重感染（Mtb/HIV雙重感染）是結(jié)核病和艾滋病防治工作面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一，據(jù)WHO報(bào)道:2010年全球880萬新增結(jié)核病患者中，有110萬(1/8)合并HIV感染，其中約1/3患者病情迅速惡化，短期內(nèi)發(fā)生死亡。目前針對(duì)Mtb/HIV雙重感染者的治療主要是抗結(jié)核和抗病毒藥物治療，面臨服用多種藥物、毒副作用大、療程長、易產(chǎn)生耐藥性等問題，因此亟須開發(fā)對(duì)雙重感染者行之有效的治療方法！
　　Mtb和HIV

2、屬于胞內(nèi)感染病原體，體液免疫難以對(duì)其發(fā)揮作用，抗Mtb和HIV的免疫機(jī)制主要是細(xì)胞免疫。Mtb/HIV雙重感染者體內(nèi)存在嚴(yán)重的細(xì)胞免疫功能缺陷，主要表現(xiàn)在:效應(yīng)CD4+Th1(T helper 1)細(xì)胞數(shù)量極度減少，功能明顯下降，IFN-γ(interferon-gamma)、TNF-α(tumor necrosis factor-α)分泌量減少;效應(yīng)CD8+CTL(cytotoxic T lymphocyte cells)殺傷活性降低

3、，IFN-γ、TNF-α、穿孔素和顆粒酶的分泌明顯減少，對(duì)致病菌的殺傷活性減弱，不能有效控制疾病。
　　有研究表明，通過過繼輸注效應(yīng)T細(xì)胞給免疫低下或免疫缺陷的患者，可將保護(hù)性免疫傳遞給受者，增強(qiáng)受者體內(nèi)效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)靶抗原的特異性識(shí)別及殺傷能力并改善患者的免疫狀態(tài)。有文獻(xiàn)表明，對(duì)結(jié)核患者過繼輸注效應(yīng)T細(xì)胞可清除患者體內(nèi)的結(jié)核桿菌。另外，將患者自體體外擴(kuò)增的CD8+CTL過繼輸入治療HIV病人已取得了明顯的療效。但是過繼輸注效應(yīng)T細(xì)

4、胞治療Mtb/HIV雙重感染者的研究未見報(bào)道，原因可能是雙重感染者體內(nèi)效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量少，體外分離及大量擴(kuò)增難度極大，限制了其臨床應(yīng)用。
　　T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)是T細(xì)胞表面特異性識(shí)別抗原和介導(dǎo)免疫應(yīng)答的效應(yīng)分子。近二十年來，有學(xué)者分離抗原特異TCR基因并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)至初始T細(xì)胞中，使該T細(xì)胞表達(dá)外源TCR并獲得特異性識(shí)別抗原的能力，通過這一方法，可短期內(nèi)獲得大量抗原特異的效應(yīng)T細(xì)胞，為過繼細(xì)胞免疫治療（

5、adoptive cellular immunotherapy，ACT）提供新途徑?？乖禺怲CR基因修飾T細(xì)胞過繼輸注治療白血病、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、巨細(xì)胞病毒感染、EB病毒感染等疾病已取得了鼓舞人心的治療效果，被證明是一種有前景的治療策略。
　　我們之前的研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核38kDa抗原特異TCR基因修飾的CD4+、CD8+T細(xì)胞均能特異性識(shí)別結(jié)核抗原并發(fā)揮免疫活性。此外未見有關(guān)結(jié)核TCR基因修飾的報(bào)道。針對(duì)HIV抗原特異的TCR基因修

6、飾T細(xì)胞的研究也有報(bào)道，證明修飾的CD8+T細(xì)胞具有良好的抗HIV活性。2011年Blood報(bào)道了HofmannC.et a1.等的研究，通過RNA電穿孔他們將兩種HIV-1肽特異的TCRs同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)至T細(xì)胞中，并篩選出可同時(shí)表達(dá)兩種外源性TCRs的T細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)表明，表達(dá)雙外源性TCR基因的T細(xì)胞具有雙特異性，可同時(shí)識(shí)別兩種HIV-1肽，并能分泌效應(yīng)細(xì)胞因子和介導(dǎo)殺傷活性。然而，分離針對(duì)TB抗原和HIV抗原特異的TCR基因，并將兩種T

7、CR基因同時(shí)轉(zhuǎn)染T細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)兩種抗原的特異性識(shí)別能力和免疫活性的研究尚未見報(bào)道。
　　TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，內(nèi)源性與外源性TCRα、β鏈之間的配對(duì)形成的雜合TCR將會(huì)稀釋轉(zhuǎn)導(dǎo)TCR在T細(xì)胞表面的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)TCR的表達(dá)量下降、細(xì)胞活性降低。為此，我們采用三種策略來解決錯(cuò)配:
　　1）將MtbAg85B199-207特異的TCRα、β鏈恒定區(qū)(constant region，C)進(jìn)行最小突變改造;
　　2）

8、將HIV-1Env120-128特異的TCRα、β鏈部分C區(qū)替換為完整的CD3分子;
　　3）采用3個(gè)2A肽段(P2A，T2A，F(xiàn)2A)連接上述四條基因片段以促使它們均衡表達(dá)。
　　據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，將人TCRα、β鏈C區(qū)9個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸替換為鼠源性氨基酸（最小突變）可促使轉(zhuǎn)導(dǎo)TCRα、B鏈間正確配對(duì)，使之與CD3分子結(jié)合更加緊密，并提高轉(zhuǎn)導(dǎo)TCR在修飾細(xì)胞表面的表達(dá)水平和介導(dǎo)增強(qiáng)的抗原識(shí)別功能。另外，將TCRα、β鏈部分胞外

9、區(qū)、跨膜區(qū)與胞漿區(qū)替換為完整的CD3(<)分子可極大程度地保證轉(zhuǎn)導(dǎo)TCRαβ:CD3(~)的正確配對(duì)并顯著提高轉(zhuǎn)導(dǎo)TCR在修飾T細(xì)胞表面的表達(dá)水平與功能。同時(shí)，為了實(shí)現(xiàn)這四條基因片段的均衡表達(dá)，我們采用2A肽段對(duì)其進(jìn)行連接。2A序列的共同特點(diǎn)是在其C端含有保守序列GDVE(S/E)NPGP，可在其序列末端的甘氨酸和脯氨酸之間發(fā)生自剪切作用，形成均衡表達(dá)的兩個(gè)肽段。有文獻(xiàn)報(bào)道，2A肽介導(dǎo)的剪切效率幾乎達(dá)到100％，可使基因產(chǎn)物近乎實(shí)現(xiàn)等量

10、表達(dá)。
　　我們分別分離出Mtb Ag85B199-207（KLVANNTRL）和HIV-1 EnV120-128(KLTPLCVTL)特異的TCR基因，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將兩種TCRs基因同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)至初始CD8+T細(xì)胞，使其同時(shí)表達(dá)這兩種抗原肽特異的TCRs。研究表明，雙TCR基因修飾的T細(xì)胞可特異性地識(shí)別和殺傷負(fù)載Ag85B199-207或Env120-128的DC，并分泌效應(yīng)細(xì)胞因子。本研究為Mtb/HIV雙抗原特異性TCR基

11、因修飾T細(xì)胞應(yīng)用于Mtb/HIV雙重感染者的過繼細(xì)胞免疫治療研究提供基礎(chǔ)。
　　方法：
　?。ㄒ唬┖Y選Ag85B199-207特異的TCR與Env120-128特異的TCR
　?、俨捎昧馨图?xì)胞分離液分離HLA-A*0201型健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC);
　?、谟?jì)數(shù)PBMC，調(diào)整PBMC數(shù)目為1×106/孔，每孔細(xì)胞分別加入含MtbAg

12、85B199-207肽、HIV-1Env120-128肽50ng/ml的10％FBS-1640培養(yǎng)基2ml;
　?、?7℃、5％CO2條件下培養(yǎng)2h后，加入IL-225U/ml，第三天補(bǔ)加IL-2至50U/ml，第五天加入IL-2100U/ml，之后以此濃度繼續(xù)培養(yǎng)11天;
　?、艽胖榉诌xCD8+T細(xì)胞，提取mRNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;
　?、莼パa(bǔ)決定區(qū)3（complementarity determining re

13、gion 3，CDR3）譜型分析檢測(cè)刺激前后CDR3譜型，找出刺激后呈單克隆增生的Ag85B199-207特異的與Env120-128特異的TCRα、β基因家族。
　?。ǘ?gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與病毒滴度測(cè)定
　　①根據(jù)GeneBank報(bào)道的人TCRα、β基因家族上游可變區(qū)(variable region，V)和下游C區(qū)基因序列，設(shè)計(jì)TCRα、β鏈全長基因上、下游引物，擴(kuò)增出Ag85B199-207特異的α13、β16和E

14、nv120-128特異的α11、β18基因;
　?、趨⒄瘴墨I(xiàn)將Ag85B199-207特異的TCRα、β鏈C區(qū)的9個(gè)氨基酸替換為相應(yīng)位點(diǎn)的鼠源性氨基酸。設(shè)計(jì)C區(qū)突變位點(diǎn)處上、下游引物，采用重組PCR方法將TCRα、β鏈C區(qū)的9個(gè)關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行置換;
　?、鄹鶕?jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)TCRα、β鏈C區(qū)下游與CD3(<)分子融合位點(diǎn)處的重組引物，將Env120-128特異的TCRα11、β18基因片段與CD3(（)分子進(jìn)行融合;
　

15、?、芾弥亟MPCR技術(shù)，將已進(jìn)行氨基酸置換的Ag85B199-207特異的TCRα13、β16基因片段通過自剪切多肽P2A進(jìn)行連接，以獲得最小突變TCR;
　?、萃ㄟ^F2A上的AgeI酶切位點(diǎn)將Env120-128特異的α11-CD3(~)、β18-CD3(g)融合基因進(jìn)行拼接;
　?、尥ㄟ^T2A上的AatⅡ酶切位點(diǎn)將上述四條基因片段進(jìn)行連接;④⑤⑥步所得到的三種基因片段測(cè)序鑒定后插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-IRES-GFP;

16、
　?、卟捎弥|(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將三種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒pMX-hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-IRES-GFP、pMX-hβ18-CD3(~)-F2A-hα11-CD3(~)-IRES-GFP、pMX-hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-T2A-hβ18-CD3(~)-F2A-hα11-CD3(~)-IRES-GFP與包膜蛋白質(zhì)粒VSV-G共轉(zhuǎn)染GP2-293;
　?、嗍占?8h-72h病毒上清，低溫超速

17、離心濃縮純化病毒;
　?、嶂亟M病毒感染NIH3T3細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病毒滴度，計(jì)算公式:病毒滴度(IU/ml)=NIH3T3細(xì)胞數(shù)×GFP陽性率/病毒濃縮液量(ml)。
　?。ㄈ㏕CR基因修飾T細(xì)胞
　　①采用Ficoll密度梯度離心法，分離HLA-A*0201型健康志愿者外周血PBMC;
　?、诖胖榉诌xCD8+T細(xì)胞;
　?、跧L-2和抗-CD3單抗活化分選出的T細(xì)胞;
　　④按已摸索好的感染復(fù)

18、數(shù)（multiplicity of infection，MOI），即MOI=13將上述三種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染CD8+T細(xì)胞;
　?、軮L-2和抗-CD3單抗刺激感染后的T細(xì)胞;
　?、蘖魇郊?xì)胞術(shù)檢測(cè)病毒感染后GFP表達(dá)陽性率。
　?。ㄋ模㏕CR基因修飾T細(xì)胞活性測(cè)定
　　按已摸索好的效靶比（effector∶target，E∶T），將TCR基因修飾T細(xì)胞與負(fù)載抗原肽的DC/未負(fù)載抗原肽的DC共同培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置如下

19、:
　　①TB/I-HIV Td+DC-Ag85B199-207組間比較:陰性對(duì)照組（Ag85B199-207+Env120-128特異TCRs基因共修飾的CD8+T細(xì)胞+DC）、未轉(zhuǎn)染組（未轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞+負(fù)載Ag85B199-20的DC）、空載體轉(zhuǎn)染組（空載體轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞+負(fù)載Ag85B199-207的DC）、無關(guān)肽組（Ag85B199-207+Env120-128特異TCRs基因共修飾的CD8+T細(xì)胞+負(fù)載PP65

20、495-503的DC）、TB/HIV Td+DC-Ag85B199-207組(Ag85B199-207+EnV120-128特異TCRs基因共修飾的CD8+T細(xì)胞+負(fù)載Ag85B199-207的DC);
　?、赥B/I-IIV Td+DC-Env120-128組間比較包括:陰性對(duì)照組（Ag85B199-207+Env120-128特異TCRs基因共修飾的CD8+T細(xì)胞+DC）、未轉(zhuǎn)染組（未轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞+負(fù)載Env120-12

21、8的DC）、空載體轉(zhuǎn)染組（空載體轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞+負(fù)載Env120-128的DC）、相關(guān)肽組（Ag85B199-207+Env120-128特異TCRs基因共修飾的CD8+T細(xì)胞+負(fù)載PP65495-503的DC）、TB/HIV Td+DC-Env120-128組(Ag85B199-207+Env120-128特異TCRs基因共修飾的CD8+T細(xì)胞+負(fù)載Env120-128的DC);
　?、跿B Td+DC-Ag85B199-2

22、07組間比較包括:陰性對(duì)照組（Ag85B199-207特異TCR基因修飾的CD8+T細(xì)胞+DC）、未轉(zhuǎn)染組（未轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞+負(fù)載Ag85B199-207的DC）、空載體轉(zhuǎn)染組（空載體轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞+負(fù)載Ag85B199-207的DC）、無關(guān)肽組（Ag85B199-207特異TCR基因修飾的CD8+T細(xì)胞+負(fù)載PP65495-503的DC）、TB Td+TB-DC組（Ag85B199-207特異TCR基因修飾的CD8+T細(xì)胞+負(fù)

23、載Ag85B199-207的DC）;
　?、蹾IV Td+DC-Env120q28組間比較包括:陰性對(duì)照組（Env120-128特異TCR基因修飾的CD8+T細(xì)胞+DC）、未轉(zhuǎn)染組(未轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞+負(fù)載Env120q28的DC)、空載體轉(zhuǎn)染組（空載體轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞+負(fù)載Env120-128的DC）、無關(guān)肽組（Env120-128特異TCR基因修飾的CD8+T細(xì)胞+負(fù)載PP65495-503的DC）、HIVTd+Env12

24、0-128組（Env120-128特異TCR基因修飾的CD8+T細(xì)胞+負(fù)載Env120-128的DC）;
　?、軹B/HIV Td+DC-Ag85B199-207與TBTd+DC-Ag85B199-207組間比較:TB/HIVTd+DC-Ag85B199-207組（Ag85B199-207+Env120-128特異TCRs基因共修飾的CD8+T細(xì)胞+負(fù)載Ag85B199-207的DC）、TB Td+DC-Ag85B199-207（

25、Ag85B199-207特異TCR基因修飾的CD8+T細(xì)胞+負(fù)載Ag85B199-207的DC）;
　　⑥TB/HIV Td+DC-Env120-128與HIV Td+DC-Env120-128組間比較:TB/HIV Td+DC-Env12o-128組（Ag85B199207+Env120-128特異TCRs基因共修飾的CD8+T細(xì)胞+負(fù)載Env120-128的DC）、HIV Td+DC-Env120-128組（Env120-12

26、8特異TCR基因修飾的CD8+T細(xì)胞+負(fù)載Env120-128的DC）。以下實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)置均同此，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。混合培養(yǎng)后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α的分泌水平用酶聯(lián)免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）進(jìn)行檢測(cè);CD8+T細(xì)胞對(duì)負(fù)載抗原肽的DC的殺傷活性用時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)(time-resolved fluoroimmuno-assay，TRFIA)進(jìn)行檢測(cè)。<

27、br>　　（五）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有計(jì)量資料用(x)+S表示，不同處理組間CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌水平、殺傷活性方差齊性時(shí)采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，方差不齊時(shí)采用Welch法進(jìn)行校正，多重比較方差齊性時(shí)用LSD法，方差不齊時(shí)用Dunnett'sT3法，雙TCR基因修飾組與單TCR基因修飾組之間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

28、　　結(jié)果：
　?。ㄒ唬┓治龃碳で昂驝DR3譜型，篩選出Ag85B199-207特異的TCR與Env120q28特異的TCR
　　對(duì)CDR3譜型進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，抗原肽刺激前T細(xì)胞各TCRVα(0α chain variable gene)、Vβ(β chain variable gene)基因家族CDR3譜型呈8個(gè)或多于8個(gè)峰型的高斯分布(Gaussian distribution)，表現(xiàn)為多家族性和多克隆性。而抗原肽刺激后，

29、一個(gè)或兩個(gè)TCR基因家族CDR3譜型發(fā)生改變，呈現(xiàn)偏態(tài)分布或者單峰分布，表明這些家族是因抗原肽的刺激而出現(xiàn)了寡克隆或單克隆增生。通過比較刺激前后的CDR3譜型，我們?cè)贑D8+T細(xì)胞中分別找到了針對(duì)Ag85B199-207特異的Vα13、Vβ16和Env120-128特異的Vα11、Vβ18基因家族。
　?。ǘ?gòu)建重組載逆轉(zhuǎn)錄病毒載體并檢測(cè)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度
　　成功擴(kuò)增出Ag85B199-207特異的TCRα13、β16

30、和Env120-128特異的α11、β18基因片段，分別將其克隆至pGEM-T載體后測(cè)序鑒定，結(jié)果與GeneBank報(bào)道的序列一致。采用重組PCR方法，擴(kuò)增Ag85B199-207特異的TCRhVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα融合基因，通過酶切連接的方法獲得Env120-128特異的TCRhβ18-CD3(~)-F2A-hα11-CD3(~)與hVβ16mCα-P2A-hVα13mCβ-T2A-hβ18-CD3(~)-F2A-h

31、α11-CD3(~)融合基因，將上述三種基因片段分別插入pMX-IRES-GFP，構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒pMX-hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-IRES-GFP、pMX-hβ18-CD3(<)-F2A-hα11-CD3(<)-IRES-GFP、與pMX-hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCα-T2A-hβ18-CD3(~)-F2A-hα11-CD3(~)-IRES-GFP。將上述三種表達(dá)質(zhì)粒與包膜蛋白質(zhì)粒VSV-G共

32、轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞GP2-293，48h-72h后收取病毒上清，低溫超離濃縮純化后感染NIH3T3細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NIH3T3細(xì)胞GFP表達(dá)陽性率，經(jīng)計(jì)算三種重組病毒滴度分別為1.59×107IU/m1、2.14×107IU/ml、8×106IU/ml。
　?。ㄈ㏕CR基因修飾CD8+T細(xì)胞的活性檢測(cè)
　?、賂CR基因修飾CD8+T細(xì)胞IFN-γ分泌水平的檢測(cè)
　　按E:T=7，將TCR基因修飾CD8+T細(xì)胞和負(fù)載抗原

33、肽的DC或未負(fù)載抗原肽的DC或混合培養(yǎng)18h，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中IFN-γ的分泌水平。結(jié)果顯示，雙TCR基因修飾組(TB/HIV Td+DC-Ag85B199-207組與TB/HIV Td+DC-Env120-128組)和僅轉(zhuǎn)導(dǎo)一個(gè)特異TCR的T細(xì)胞組(TB Td+DC-Ag85B199-207組與HIV Td+DC-Env120-128組)與各對(duì)照組相比，IFN-γ分泌水平組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（上述四組的F值和P值分別是F=1

34、1153.161，P<0.001;F=293.133，P<0.001;F=311.915，P<0.001;F=166.283,P<0.001）。將TB/HIV Td+DC-Ag85B199-207組與TB Td+DC-Ag85B199-207組、TB/HIV Td+DC-Env120-128組與HIV Td+DC-Env120-128組進(jìn)行比較，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.313，P=0.001;t=14.603，P<0.001）

35、。TB/HIV Td+DC-Ag85B199-207組IFN-γ分泌量是1117.921pg/ml，是TB Td+DC-Ag85B199-207組分泌量的78.29％;TB/HIV Td+DC-Env120-128組IFN-γ的分泌量是655.336pg/ml，是HIV Td+DC-Env120-128組分泌量的46.75％。
　?、赥CR基因修飾CD8+T細(xì)胞TNF-α分泌水平的檢測(cè)
　　按E:T=20，將TCR基因修飾C

36、D8+T細(xì)胞和負(fù)載抗原肽的DC或未負(fù)載抗原肽的DC混合培養(yǎng)24h，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中TNF-α的分泌水平。結(jié)果顯示，雙TCR基因修飾組(TB/HIV Td+DC-Ag85B199-207組與TB/HIV Td+DC-Env120-128組)和僅轉(zhuǎn)導(dǎo)一個(gè)特異TCR的T細(xì)胞組(TB Td+DC-Ag85B199-207組與HIV Td+DC-EnV120-128組)與各對(duì)照組相比，TNF-α分泌水平組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（上述四組的F

37、值和p值分別是F=166.999，P<0.001;F=38.098，P=0.001;F=499.580，P<0.001;F=110.109,P<0.001)。將TB/HIV Td+DC-Ag85B199-207組與TB Td+DC-Ag858199-207組、TB/HIV Td+DC-Env120-128組與HIV Td+DC-Env120-128組進(jìn)行比較，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-9.219，P=0.001;t=5.427，P

38、=0.006)。TB/HIV Td+DC-Ag85B199-207組TNF-α的分泌量是738.840pg/ml，是TB Td+DC-Ag85B199-207組分泌量的71.03％;TB/HIV Td+DC-Env120-128組TNF-α的分泌量是660.337pg/ml，是HIV Td+DC-Env120-128組分泌量的65.43％。
　?、跿CR基因修飾CD8+T細(xì)胞的殺傷效應(yīng)
　　按E:T=30，將TCR基因修飾C

39、D8+T細(xì)胞和負(fù)載抗原肽的DC或未負(fù)載抗原肽的DC混合培養(yǎng)，時(shí)間分辨免疫熒光法檢測(cè)TCR基因修飾CD8+T細(xì)胞對(duì)DC或負(fù)載抗原肽的DC的殺傷活性。結(jié)果顯示，雙TCR基因修飾組(TB/HIV Td+DC-Ag85B199-207組與TB/HIV Td+DC-Env120-128組)和僅轉(zhuǎn)導(dǎo)一個(gè)特異TCR的T細(xì)胞組(TB Td+DC-Ag85B199-207組與HIV Td+DC-Env120-128組)與各對(duì)照組相比，對(duì)靶細(xì)胞的殺傷水平組

40、間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（上述四組的F值和尸值分別是F=372.417,P<0.001;F=114.856,P<0.001;F=812.729,P<0.001;F=78.281,P<0.001)。將TB/HIV Td+DC-Ag85B199-207組與TB Td+DC-Ag85B199-207組、TB/HIV Td+DC-Env120-128組與HIV Td+DC-Env120-128組進(jìn)行比較，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)

41、學(xué)意義（t=9.527，P=0.001;t=7.579，P=0.002）。TB/HIV Td+DC-Ag85B199-207組殺傷率是35.16％，是TB Td+DC-Ag85B199-207組殺傷率的61.21％;TB/HIV Td+DC-Env120-128組殺傷率是23.89％，是HIVTd+DC-Env120-128組殺傷率的51.4％。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)中采用Mtb Ag85B199-207與HIV-1 En

42、v120-128刺激HLA-A*0201型健康志愿者外周血CD8+T細(xì)胞，分別獲得針對(duì)這兩種抗原肽特異的TCR。通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)將這兩種TCR同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)至初始CD8+T細(xì)胞，獲得了可同時(shí)表達(dá)兩種外源性TCR的T細(xì)胞。結(jié)果表明雙TCR基因修飾的T細(xì)胞具有雙特異性，它可針對(duì)Mtb和HIV-1兩種病原體表位發(fā)生反應(yīng)，并具有細(xì)胞因子分泌功能與殺傷活性。但將其與僅表達(dá)一種外源性TCR的T細(xì)胞進(jìn)行比較時(shí)，其細(xì)胞因子分泌功能和殺傷活性弱于后者。盡