MTB Ag85B199-207和HIV-1 Env120-128雙特異TCR基因修飾CD8+T細(xì)胞及其活性研究.pdf

1、結(jié)核病和人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type1，HIV-1)感染是全球最致命的慢性感染疾病。結(jié)核是HIV感染者發(fā)病率和死亡率升高的主要原因，也更容易在HIV感染人群中進(jìn)行播散。據(jù)WHO統(tǒng)計報告，2013年全球新增結(jié)核病人900萬，其中110萬(13％)共感染HIV;全球結(jié)核死亡人數(shù)150萬，其中1/4為合并感染HIV致死。在宿主中，結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberc

2、ulosis，MTB）和HIV彼此加強(qiáng)相互作用，加快免疫功能的弱化或喪失。結(jié)核潛伏感染者，一旦再感染HIV，會加速破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)，主要使CD4+T淋巴細(xì)胞的功能下降和數(shù)量減少，激活原本受抑制的MTB，使之更容易發(fā)展成活動性結(jié)核。同時，MTB通過刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞大量分泌單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）促進(jìn)HIV的轉(zhuǎn)錄，加速病毒增殖，促使病情惡化。目前，MTB/H

3、IV雙重感染者的治療主要是異煙肼預(yù)防治療與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的結(jié)合，其療程長，多種藥物相互作用，藥物重疊的毒副作用大，易產(chǎn)生耐藥性，病人服藥依從性差，對這兩種疾病同時有效的藥物稀缺，整合異煙肼預(yù)防治療與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療存在時間和藥物選擇的巨大挑戰(zhàn)，以及出現(xiàn)免疫重建炎癥綜合癥等問題。因此，亟需開發(fā)針對MTB/HIV共感染行之有效的治療方法。
　　抗MTB/HIV共感染的主要免疫機(jī)制是以T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主。已有大量實驗證據(jù)表明，抗

4、原特異性CD8+T細(xì)胞在控制MTB和HIV感染中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。效應(yīng)CD8+T細(xì)胞通過以下兩種途徑來發(fā)揮作用:1）發(fā)揮細(xì)胞毒作用，通過穿孔素和顆粒酶B(granzyme B，GrB)途徑直接殺傷感染靶細(xì)胞;2）釋放Th1型細(xì)胞因子，如干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），抑制病原體復(fù)制，促進(jìn)巨噬細(xì)胞清除胞內(nèi)病原體。然而，在MTB/HIV共

5、感染者體內(nèi)，其免疫功能明顯紊亂，表現(xiàn)為T細(xì)胞增殖反應(yīng)下降，效應(yīng)CD8+T細(xì)胞數(shù)量和反應(yīng)水平均很低，白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）和IFN-γ產(chǎn)生顯著減少。因此，通過過繼轉(zhuǎn)移大量效應(yīng)CD8+T細(xì)胞至MTB/HIV共感染者體內(nèi)，可增強(qiáng)其抗MTB/HIV感染的能力。
　　過繼細(xì)胞免疫治療已在抗MTB和HIV感染中顯示了巨大潛力。Kitsukawa等利用滅活的結(jié)核菌體外致敏PBL，將其回輸給多藥耐藥肺結(jié)核患者，取得

6、良好療效。Lieberman等將患者自體HIV特異性CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxie T lymphocyte，CTL)過繼回輸治療6例HIV感染者，最初2周所有患者CD4計數(shù)增加，5名患者血漿病毒血癥減少。24周后，2名患者的HIV病毒負(fù)載繼續(xù)減少，另1名患者CD4計數(shù)增加超過2倍。盡管過繼細(xì)胞免疫治療展現(xiàn)出光明的前景，但這種方法的廣泛應(yīng)用卻存在許多障礙。
　　有研究者提出，在人初始T細(xì)胞池中，不同特異性的TCR種

7、類＜108，而潛在外源肽＞1015，因此，TCR的數(shù)量與大量潛在的外源肽-MHC復(fù)合物相比，是相形見絀的。適應(yīng)性T細(xì)胞免疫要求每個T細(xì)胞都能識別大量與細(xì)胞異常相關(guān)的潛在抗原肽，這種現(xiàn)象可以由T細(xì)胞的交叉反應(yīng)性來解釋。最近報道的從Ⅰ型糖尿病患者分離的1E6 TCR具有非常大的交叉反應(yīng)性。表達(dá)1E6 TCR的T細(xì)胞除了識別前胰島素原來源的HLA-A*0201限制性PPI15-24肽（ALWGPDPAAA）以外，還至少對130萬個十肽產(chǎn)生反應(yīng)

8、，反應(yīng)強(qiáng)度與PPI15-24一樣強(qiáng)烈。在這些大量肽中，活化表達(dá)1E6 TCR的T細(xì)胞時，RQFGPDFPTI比PPI15-24的活性強(qiáng)100倍以上，盡管它與PPI15-24在組成上有七個氨基酸不一致。因此，我們完全有理由相信可以找到一個單一TCR同時識別兩種抗原肽。
　　目的:
　　本文首次提出通過轉(zhuǎn)導(dǎo)一個TCR同時產(chǎn)生針對兩種不相似病原體抗原肽的活性反應(yīng)，為MTB/HIV共感染患者的免疫治療提供新的思路。利用分別負(fù)載MTB

9、肽Ag85B199-207(KLVANNTRL)和HIV-1肽Env120-128(KLTPLCVTL)的樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)反復(fù)刺激HLA-A*0201型健康人外周血CD8+T細(xì)胞，通過互補(bǔ)決定區(qū)3（complementarity determining region3，CDR3）譜型分析，篩選出同時對Ag85B199-207和Env120-128特異的單一TCR，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將雙特異TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至

10、普通CD8+T細(xì)胞中使其表達(dá)。研究結(jié)果顯示，雙特異TCR基因修飾的CD8+T細(xì)胞既可針對Ag85B199-207產(chǎn)生高水平的IFN-γ、TNF-α和GrB分泌及特異性殺傷，同時也可針對Env120-128產(chǎn)生顯著的效應(yīng)反應(yīng)。本研究為MTB/HIV共感染過繼細(xì)胞免疫治療奠定了基礎(chǔ)，同時也為其他共感染疾病的免疫治療研究提供了模式和平臺。
　　方法:
　　1.篩選Ag85B199-207和Env120-128雙特異TCR
　

11、　1)采用淋巴細(xì)胞分離液分離HLA-A*0201型健康志愿者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC);
　　2)PBMC貼壁培養(yǎng)2h后，吸出懸浮細(xì)胞，往貼壁細(xì)胞中加入100 ng/mL重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombinant human granulocytemacrophage colony-stimulating factor, rhGM-CSF)和10

12、0 ng/mL重組人白細(xì)胞介素-4（recombinant human interleukin-4，rhIL-4）誘導(dǎo)DC;
　　3)MTB肽Ag85B199-207（50μg/mL）和HIV-1肽Env120-128（50μg/mL）分別沖擊致敏DC;
　　2.重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建與病毒滴度測定
　　1)根據(jù)NCBI網(wǎng)站GeneBank報道的人TCRα、β基因家族上游可變區(qū)(variableregion，V)和下游

13、恒定區(qū)(constant region，C)基因序列，設(shè)計TCRα和β鏈全長基因上、下游引物，擴(kuò)增出Ag85B199-207和Env120-128雙特異的α17和β15基因;
　　2)根據(jù)文獻(xiàn)報道的影響外源TCR基因表達(dá)和功能的C區(qū)9個關(guān)鍵氨基酸序列，分別設(shè)計α和β鏈C區(qū)突變位點上、下游引物，利用重組PCR方法將TCRα、β鏈C區(qū)9個關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行替換;
　　3)利用重組PCR技術(shù)，將TCRα和β基因通過自剪切多肽P2A連接

14、，測序鑒定正確后插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-IRES-GFP，酶切鑒定;
　　結(jié)果:
　　1.分析抗原肽刺激前后CDR3譜型，篩選出MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128雙特異TCR
　　通過對CDR3譜型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，抗原肽刺激前健康志愿者外周血T細(xì)胞各TCR Vα（αchain variable gene）、Vβ(β chain variable gene)基因家族CDR3譜型均呈8個或8

15、個以上峰型的高斯分布，表現(xiàn)為多克隆性。
　　2.構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體
　　成功擴(kuò)增出MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128雙特異的α17和β15全長基因片段，將其克隆至pGEM-T載體后測序鑒定，其V、C區(qū)DNA序列與GeneBank報道的序列完全一致。利用重組PCR技術(shù)，將人Cα、Cβ區(qū)9個關(guān)鍵位點的氨基酸替換為鼠C區(qū)相應(yīng)位點氨基酸，擴(kuò)增出hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα融合基因

16、，將其插入pMX-IRES-GFP載體，構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒pMX-hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα-IRES-GFP，酶切鑒定證實基因片段插入正確。
　　結(jié)論:
　　本研究利用分別負(fù)載MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128的DC反復(fù)刺激HLA-A*0201型健康志愿者外周血CD8+T細(xì)胞，通過CDR3譜型分析，獲得針對這兩種抗原肽共同特異的單個TCR。通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-I

17、RES-GFP介導(dǎo)，將該雙特異TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)至初始CD8+T細(xì)胞，人為賦予其識別特異性抗原的能力。由于外源性TCRα、β鏈可能與內(nèi)源性TCRα、β鏈發(fā)生錯配，因此，為了減少錯配機(jī)率，同時增加外源性TCR的表達(dá)和功能，我們對雙特異TCR進(jìn)行最小突變，即將人C區(qū)9個關(guān)鍵位點氨基酸替換為鼠C區(qū)相應(yīng)位點氨基酸。我們將最小突變的雙特異TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)自體CD8+T細(xì)胞并檢測其活性，結(jié)果表明該TCR基因修飾的CD8+T細(xì)胞具有雙特異性，既可針對MTB肽A