利用APE-PCR方法篩選白血病原病毒插入位點(diǎn)及相關(guān)基因的研究.pdf

1、白血病是一類(lèi)造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病,它的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確,影響其發(fā)病的因素有很多,病毒是影響因素之一。目前一般認(rèn)為,前病毒插入性誘變激活原癌基因可以產(chǎn)生白血病。于是尋找原病毒的插入位點(diǎn),檢測(cè)白血病相關(guān)的遺傳學(xué)變異并發(fā)現(xiàn)相關(guān)的基因就具有重要的意義。另外,插入誘變對(duì)于在腫瘤生成中探索重要的生物學(xué)遺傳調(diào)節(jié)和傳導(dǎo)途徑是一種有用的策略,而這一策略的成功實(shí)施主要依賴(lài)于一種有效的方法來(lái)鑒定基因組中的插入位點(diǎn)。
　　目的：旨在研究出一種新的

2、高效簡(jiǎn)便地用于篩選白血病的原病毒插入位點(diǎn)和其他類(lèi)型DNA元件插入位點(diǎn)的PCR方法;尋找在急性髓細(xì)胞白血病(AML)發(fā)生和產(chǎn)生耐藥過(guò)程中原病毒的共同插入位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因。
　　方法：通過(guò)對(duì)原有PCR方法在酶切組合、連接效率、純化方法等方面進(jìn)行改進(jìn)得到一種用于克隆基因組DNA插入位點(diǎn)的PCR方法—末端腺苷引物延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(APE-PCR);同時(shí)構(gòu)建一種運(yùn)用阿糖胞苷(Ara-C)治療的AML小鼠模型,利用APE-PCR方法對(duì)該模

3、型中收集到的原發(fā)性腫瘤樣本進(jìn)行原病毒插入位點(diǎn)鑒定;最后利用高通量測(cè)序法分析和尋找共同插入序列和相關(guān)基因。
　　結(jié)果：已經(jīng)證實(shí)APE-PCR方法可以擴(kuò)增出更多更長(zhǎng)的原病毒插入位點(diǎn)相關(guān)片段,產(chǎn)生較低的非特異性背景,需要更少的步驟和更少的DNA樣本量,還可以靈活地選擇限制性?xún)?nèi)切酶,且花費(fèi)更低的成本。在這個(gè)方法中利用納米級(jí)的磁珠替代常規(guī)磁珠可以提高其效率,而且使用少量的DNA也可以回收和分析原病毒插入位點(diǎn)(PIS)。另外,已經(jīng)初步篩選得到