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文檔簡(jiǎn)介
1、 隨著年齡的增長(zhǎng),卵巢功能衰竭和體內(nèi)雌激素水平下降,月經(jīng)開(kāi)始紊亂甚至閉經(jīng),婦女逐漸進(jìn)入圍絕經(jīng)期,通常在45~55歲發(fā)生,婦女進(jìn)入圍絕經(jīng)期后將會(huì)有一系列疾病及癥狀的發(fā)生,如月經(jīng)紊亂,情緒不穩(wěn)定,潮紅潮熱,骨質(zhì)疏松、老年癡呆、心血管疾病等。
長(zhǎng)期以來(lái),雌激素替代療法(Estrogen replacement therapy, ERT)在治療圍絕經(jīng)期癥狀方面起到一定的作用,它可以緩解由于雌激素下降引起的各種癥狀,降低骨質(zhì)疏松性
2、骨折和腦梗的發(fā)生率。但長(zhǎng)期應(yīng)用人工合成雌激素會(huì)誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等疾病的發(fā)病。
植物雌激素(phytoestrogens)存在于一些天然植物中,具有雌激素樣作用。因與雌激素結(jié)構(gòu)類似,植物雌激素可以與體內(nèi)雌激素受體(estrogen receptors, ERs)和雌激素相關(guān)受體(estrogen relation receptor, ERR)結(jié)合起到雙向調(diào)節(jié)雌激素受體作用,顯示出雌激素樣活性。在體內(nèi)雌激素水平較低時(shí)有擬
3、雌激素樣作用;當(dāng)體內(nèi)雌激素水平較高時(shí),可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性與雌激素受體結(jié)合,抑制內(nèi)源性雌激素的作用而產(chǎn)生抗雌激素活性。因此,植物雌激素被稱為天然的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑。
本課題采用小鼠子宮增重實(shí)驗(yàn),從九種中藥中篩選具有雌激素樣活性的中藥,結(jié)合MCF-7細(xì)胞增殖拮抗實(shí)驗(yàn)和報(bào)告基因技術(shù)初步探討其發(fā)揮雌激素樣作用的機(jī)制;以鮮地黃、生地黃、熟地黃、和鮮地黃汁為研究對(duì)象,利用小鼠子宮增重實(shí)驗(yàn)對(duì)雌激素活性及活性部位進(jìn)行篩選,采用MCF-7細(xì)
4、胞增殖拮抗實(shí)驗(yàn)、報(bào)告基因技術(shù)和免疫印跡法探討鮮地黃發(fā)揮雌激素樣作用的機(jī)制;為了探討鮮地黃對(duì)成骨功能的影響,本課題以人成骨肉瘤細(xì)胞MG63為細(xì)胞模型,評(píng)價(jià)鮮地黃有效部位對(duì)MG63細(xì)胞增殖及ALP活性的影響,初步探討鮮地黃有效部位提高成骨活性的作用機(jī)制。
第一部分:地骨皮等九種中藥雌激素樣活性篩選的實(shí)驗(yàn)研究
目的:對(duì)選定的九種中藥進(jìn)行雌激素樣活性篩選研究。
方法:采用小鼠子宮增重實(shí)驗(yàn),觀察用藥前后小
5、鼠子宮系數(shù),脾臟、胸腺系數(shù)及體重變化情況,從而篩選具有雌激素樣活性的中藥;結(jié)合MCF-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、MCF-7細(xì)胞增殖拮抗實(shí)驗(yàn)以及ERE調(diào)控的報(bào)告基因瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè),評(píng)價(jià)活性中藥的雌激素樣活性,并初步探討其作用機(jī)制。
結(jié)果:地骨皮和牛膝水提物能顯著增加小鼠子宮系數(shù)(P<0.01),而其它七種水提與空白組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
地骨皮水提物(10-4 mg·mL-1~10-1 mg·mL-1)及牛膝
6、水提物(10-3 mg·mL-1~1 mg·mL-1)可顯著促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖,加入雌激素受體拮抗劑ICI182,780后,細(xì)胞增殖作用均被明顯抑制,與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。
報(bào)告基因瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示:由ERα介導(dǎo)時(shí),地骨皮水提物1 mg·mL-1組熒光素酶活性顯著高于空白組;牛膝水提物各劑量組與空白組比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由 ERβ介導(dǎo)時(shí),地骨皮各劑量組熒光素酶活性均顯著升高,與空白組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其中,1
7、0-1 mg·mL-1和 1 mg·mL-1劑量組與空白組相比具有極顯著性差異。牛膝 10-3 mg·mL-1~10-1 mg·mL-1組熒光素酶活性明顯低于空白組,其在濃度10-3 mg·mL-1和10-2 mg·mL-1時(shí)與空白組比具有極顯著性差異(P<0.01)。
結(jié)論:地骨皮和牛膝可通過(guò)雌激素受體(ER)途徑發(fā)揮其活性,地骨皮主要是通過(guò)ERβ亞型介導(dǎo)促進(jìn)下游基因的表達(dá)發(fā)揮雌激素樣作用,而牛膝主要是通過(guò)ERβ亞型介導(dǎo)
8、抑制下游基因表達(dá)發(fā)揮雌激素拮抗效應(yīng)。
第二部分:鮮地黃雌激素樣作用的實(shí)驗(yàn)研究
目的:對(duì)鮮地黃、生地黃、熟地黃及鮮地黃汁進(jìn)行體內(nèi)雌激素樣活性篩選;并對(duì)鮮地黃進(jìn)行活性部位篩選,初步探討其作用機(jī)制。
方法:同第一部分,并結(jié)合免疫印跡法(western blot)。
結(jié)果:小鼠子宮增重實(shí)驗(yàn):生地黃水提物和鮮地黃水提物顯著增加小鼠子宮系數(shù)(P<0.01),而熟地黃、地黃葉和鮮地黃汁組與空白對(duì)
9、照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;鮮地黃醇提物各劑量組顯著增加小鼠子宮系數(shù),其中鮮地黃醇提物中劑量組小鼠子宮系數(shù)與空白組相比有極顯著性差異(P<0.01);而鮮地黃藥渣水提物與空白組相比無(wú)顯著性差異。
MCF-7增殖拮抗實(shí)驗(yàn):24 h和48 h時(shí),鮮地黃醇提物(10-4 mg·mL-1~10-1 mg·mL-1)顯著促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖,而72 h時(shí),鮮地黃醇提物(10-4 mg·mL-1~10-1 mg·mL-1)促M(fèi)CF-7細(xì)胞
10、增殖作用顯著下降,與空白組比較無(wú)顯著性差異。48 h時(shí),ICI182, 780顯著性抑制鮮地黃醇提物各劑量組促M(fèi)CF-7細(xì)胞增殖。
報(bào)告基因結(jié)果顯示:由ERα介導(dǎo)時(shí),鮮地黃醇提物1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)化后熒光素酶活性顯著性高于空白組(P<0.01);由ERβ介導(dǎo)時(shí),鮮地黃醇提物10-3 mg·mL-1、10-1 mg·mL-1、1 mg·mL-1組標(biāo)準(zhǔn)化后的熒光素酶活性顯著升高,其中,10-1 mg·mL-1、1 mg·m
11、L-1組與空白組比較具有極顯著性差異(P<0.01)。
Western blot結(jié)果顯示:鮮地黃醇提物1 mg·mL-1時(shí)明顯促進(jìn)MCF-7細(xì)胞ERα蛋白的表達(dá),與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.05);鮮地黃醇提物(0.001 mg·mL-1~0.1 mg·mL-1)各劑量組均能顯著促進(jìn)ERβ蛋白的表達(dá),與空白對(duì)照組比有極顯著性差異(P<0.01)。
結(jié)論:鮮地黃和生地黃具有雌激素樣活性,其中鮮地黃醇
12、提物是其發(fā)揮雌激素樣作用的活性部位。鮮地黃醇提物是通過(guò)雌激素受體ER介導(dǎo)而發(fā)揮雌激素樣作用,且主要是通過(guò)ERβ亞型介導(dǎo),并可顯著提高M(jìn)CF-7細(xì)胞ERβ蛋白的表達(dá),對(duì)ERα蛋白表達(dá)影響較小。
第三部分:鮮地黃活性部位對(duì)成骨細(xì)胞增殖和成骨活性影響的實(shí)驗(yàn)研究
目的:探討鮮地黃活性部位對(duì)成骨活性的影響。
方法:用MTT增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鮮地黃醇提物對(duì)MG63細(xì)胞增殖的影響,并用檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鮮地黃醇提物及I
13、CI182, 780和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)阻斷劑U0126干預(yù)后對(duì)MG63細(xì)胞ALP活性的影響。
結(jié)果:MG63增殖實(shí)驗(yàn):24h和36h時(shí),鮮地黃醇提物(0.001 mg·mL-1~0.1 mg·mL-1)顯著促進(jìn)MG63細(xì)胞增殖(P<0.01),72h時(shí),鮮地黃醇提物各劑量組均抑制MG63細(xì)胞增殖,與空白組相比具有極顯著性差異(P<0.01),且呈劑量依賴性。
ALP活性檢測(cè):24h、48h和72h時(shí)
14、鮮地黃醇提物(10-3 mg·mL-1~10-1 mg·mL-1)均能顯著促進(jìn)MG63堿性磷酸酶活性(ALP)增加,且與空白組相比具有極顯著性差異(P<0.01),96h時(shí),鮮地黃醇提物各劑量組促M(fèi)G63堿性磷酸酶活性(ALP)作用消失,與空白組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ICI182, 780和U0126均能顯著抑制鮮地黃醇提物促M(fèi)G63堿性磷酸酶活性。
結(jié)論:鮮地黃醇提物可促進(jìn)人成骨肉瘤細(xì)胞(MG63)增殖和堿性磷酸酶活性增加,
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