治療更年期綜合征常用中藥雌激素樣作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、更年期綜合征是婦女由于卵巢功能衰退，體內(nèi)分泌的雌激素水平明顯下降，引起的心血管、神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)功能紊亂，導(dǎo)致功能性子宮出血、陣發(fā)性潮熱和出汗、外陰及陰道萎縮、骨質(zhì)疏松等癥狀及出現(xiàn)精神和植物神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀。隨著我國(guó)人口結(jié)構(gòu)不斷的老齡化，該病有發(fā)病年齡提早、發(fā)病率上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重的影響了占婦女一生中1/3時(shí)間的圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后期的健康問題和生活質(zhì)量。 更年期綜合征發(fā)病率較高，直接影響到更年期婦女的正常工作和生活，目前主要的治療方法

2、為激素替代療法。雌激素是一種作用廣泛的類固醇類激素，不僅對(duì)于女性生殖器官的發(fā)育及第二性征的保持具有不可替代的作用，而且對(duì)眾多靶組織如生殖道、乳腺、骨骼及心血管系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育功能有調(diào)節(jié)作用。雌激素替代療法對(duì)減輕更年期婦女絕經(jīng)期癥狀、防治骨質(zhì)疏松有很好的效果。然而，長(zhǎng)期激素替代療法應(yīng)用使子宮內(nèi)膜癌的患病風(fēng)險(xiǎn)增加。與孕激素聯(lián)合應(yīng)用的激素替代療法，雖然能減少這種風(fēng)險(xiǎn)，但乳腺癌及心腦血管病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加，雌激素在臨床長(zhǎng)期應(yīng)用所帶來(lái)的不良反應(yīng)一直困擾

3、著人們。 植物雌激素是一類存在于植物中、與雌激素結(jié)構(gòu)相類似的生物活性物質(zhì)，它能與雌激素受體結(jié)合，并且具有雙向調(diào)節(jié)作用。它能抑制雌激素依賴性腫瘤的生長(zhǎng)，減輕更年期綜合征。近來(lái)植物雌激素作為雌激素的替代品，以其安全性及顯著的療效，受到越來(lái)越多的關(guān)注。中草藥在我國(guó)資源豐富，但相關(guān)的植物雌激素的系統(tǒng)研究很少，所以在其中篩選具雌激素作用的藥物，并進(jìn)一步篩選有效成分意義重大，不僅在理論上，而且在臨床上也是實(shí)際可行的。 由于每種中藥的

4、成分比較復(fù)雜，并且每種中藥植物雌激素活性不同，我們根據(jù)中醫(yī)對(duì)更年期綜合征的辨證論治的原則，結(jié)合文獻(xiàn)中對(duì)某些含有植物雌激素中藥的論述，選出治療更年期綜合征的常用中藥，在此基礎(chǔ)上做進(jìn)一步精簡(jiǎn)，篩選出雌激素活性比較強(qiáng)的中藥，減少藥物服用量。同時(shí)可以根據(jù)中醫(yī)的組方原則，使中藥組合變成最佳藥物組合，發(fā)揮中藥的最大作用。本課題還可以了解植物雌激素和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑的作用路徑及其組織特異性的發(fā)生機(jī)制，最終為提高雌激素類藥物的選擇性、優(yōu)化以臨床為

5、基礎(chǔ)的藥物設(shè)計(jì)提供一條較為系統(tǒng)的思路。 本課題選取了十種治療更年期綜合征的常用中藥(淫羊藿、菟絲子、女貞子、補(bǔ)骨脂、枸杞子、肉蓯蓉、甘草、川牛膝、丹參、紅花)，這些中藥主要分為補(bǔ)腎陰藥、補(bǔ)腎陽(yáng)藥、活血化瘀藥三大類。在課題中主要從四個(gè)方面來(lái)研究中藥中的植物雌激素。 第一部分：利用小鼠子宮增重法，觀察十種中藥的雌激素和拮抗雌激素的作用。 植物雌激素在體內(nèi)雌激素水平低的時(shí)候發(fā)揮雌激素樣作用，在體內(nèi)雌激素水平高時(shí)具有拮抗

6、雌激素的作用。觀察中藥的雌激素作用時(shí)，選用剛斷乳的昆明種小鼠120只，分為12組，每組10只，每天給予受試藥物灌胃一次，連續(xù)4天后處死后取子宮稱重。以雌激素為陽(yáng)性對(duì)照藥物，以蒸餾水為正常對(duì)照組，根據(jù)藥物對(duì)性未成熟小鼠子宮生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，采用子宮系數(shù)(子宮濕重/體重×100％)為指標(biāo)評(píng)價(jià)其是否具有雌激素作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，在十種中藥中，淫羊藿、菟絲子可使動(dòng)物子宮系數(shù)明顯升高，與正常對(duì)照組相比有極顯著的差異。所有藥物誘導(dǎo)子宮系數(shù)變化后的數(shù)值

7、明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.01)。在雌激素拮抗實(shí)驗(yàn)中選用剛斷乳的昆明種小鼠120只，分為12組，每組10只，每天灌胃兩次，一次中藥，一次己烯雌酚。未見某中藥有明顯的拮抗作用。其中，女貞子、補(bǔ)骨脂不但無(wú)拮抗作用，還有增強(qiáng)己烯雌酚的作用。 第二部分：觀察十種中藥的血清對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響。采用剛斷乳的昆明種小鼠72只分成12組，分籠喂養(yǎng)3天后，分組、灌胃方法同實(shí)驗(yàn)一。第5天將小鼠摘眼球取血，在4℃條件下2500rpm離心10

8、min，抽取血清。MCF-7細(xì)胞是雌激素受體陽(yáng)性的人乳腺癌細(xì)胞，雌激素類物質(zhì)可以明顯促進(jìn)細(xì)胞的增殖。將MCF-7細(xì)胞用無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)四天。按組分別加入不同組的含藥血清，共分12組，每組重復(fù)6孔。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h后吸出培養(yǎng)液，各孔加入MTT，然后每孔再加入200μl二甲基亞砜。在酶標(biāo)儀上波長(zhǎng)為570nm條件下，檢測(cè)還原的MTT結(jié)晶的光密度值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①女貞子血清組、淫羊藿血清組、甘草血清組無(wú)明顯促進(jìn)MCF-7增殖

9、的作用。不同的中藥血清在不同時(shí)段對(duì)細(xì)胞的作用也不同。②川牛膝血清組、枸杞子血清組、紅花血清組、補(bǔ)骨脂血清組、菟絲子血清組在三個(gè)時(shí)段均有顯著的促進(jìn)MCF-7增殖作用。 拮抗組采用剛斷乳的昆明種小鼠72只，按同樣的方法制備血清，并按上述實(shí)驗(yàn)步驟測(cè)出光密度值。有以下結(jié)論：①與陽(yáng)性組比，丹參、紅花、淫羊藿、補(bǔ)骨脂、菟絲子、甘草的拮抗雌激素引起的細(xì)胞增殖作用比較緩，但作用比較強(qiáng)。川牛膝拮抗作用比較弱。②女貞子、枸杞子、肉蓯蓉?zé)o明顯拮抗雌激

10、素引起的細(xì)胞增殖作用。其中肉蓯蓉在72h時(shí)還有增強(qiáng)己烯雌酚的作用。 第三部分：通過HE染色和免疫組化觀察中藥對(duì)子宮的影響。從HE結(jié)果來(lái)看，陽(yáng)性組子宮形態(tài)大小明顯大于正常組，補(bǔ)骨脂子宮小于正常組，淫羊藿、紅花、菟絲子等中藥組在一定的程度上大于正常組子宮。正常組鏡下可見子宮內(nèi)膜、肌層、漿膜層基本結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜層腺體豐富，呈簇狀分布。陽(yáng)性組和淫羊藿、紅花、菟絲子等中藥組鏡下可見子宮內(nèi)膜、肌層、漿膜層基本結(jié)構(gòu)較清晰，內(nèi)膜層腺體較多，子宮

11、內(nèi)膜上皮細(xì)胞呈典型的增生分泌狀態(tài)，即胞漿豐富，胞體延長(zhǎng)擴(kuò)大，胞核彌散，基底層變厚。 ERα免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在未發(fā)育成熟的小鼠子宮中，ERα主要表達(dá)在子宮內(nèi)膜腔上皮和子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞上。細(xì)胞核和胞漿呈棕黃色，胞核顏色深于胞漿，說明ERα在細(xì)胞核表達(dá)要強(qiáng)于細(xì)胞質(zhì)。部分表達(dá)在內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。與正常組比，紅花、川牛膝、女貞子、枸杞子、肉蓯蓉、淫羊藿、補(bǔ)骨脂、菟絲子組與正常組相比均有顯著差異(P＜0.01)。與陽(yáng)性組比，

12、只有紅花差異不顯著，說明紅花能明顯促進(jìn)雌激素受體的表達(dá)。 第四部分：通過血清中FSH、LH、E2等測(cè)定，確定中藥對(duì)小鼠的影響。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌胃方法和分組同前。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用ELISA競(jìng)爭(zhēng)法觀測(cè)中藥對(duì)小鼠血清內(nèi)三種激素的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)論如下：①補(bǔ)骨脂組與淫羊藿組能降低小鼠血清中FSH水平。②紅花能升高小鼠血清LH值。③菟絲子和紅花能升高小鼠血清E2水平。陽(yáng)性組血清的E2低于正常組，可能是因?yàn)榧合┐品拥姆答佇缘囊种屏诵∈篌w內(nèi)E2的生成。