苯并(a)芘及其代謝產(chǎn)物體外誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)與ERCC1基因多態(tài)的關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題,其發(fā)生發(fā)展是遺傳和環(huán)境因素綜合作用的結(jié)果,找尋有效的遺傳生物學(xué)標(biāo)志,做到早期預(yù)防和合理治療,對(duì)于提高惡性腫瘤的生存率和生存質(zhì)量具有重要意義。
　　 環(huán)境致癌因子暴露所致的DNA損傷被認(rèn)為是引起多階段癌變過程的起始動(dòng)力,不同個(gè)體內(nèi)DNA修復(fù)酶活性的差異影響個(gè)體對(duì)環(huán)境致癌物所致DNA損傷的修復(fù),在惡性腫瘤的遺傳易感性中占據(jù)了核心地位。苯并(a)芘(BaP)作為一種主要的多環(huán)芳烴類(PAHs)

2、環(huán)境化學(xué)致癌污染物,由煤、煙草和其它一些有機(jī)化合物高溫加熱或燃燒不完全時(shí)產(chǎn)生。7,8-二羥-9,10-環(huán)氧苯并芘(benzo(a)pyrene-7,8-dihydrodiol-9,10-epocide,BPDE)是苯并(a)芘在體內(nèi)經(jīng)微粒體酶代謝活化后生成的終致癌物,其中反式BPDE是代謝產(chǎn)物中活性最強(qiáng)的,具有親電性碳原子活性基團(tuán),能與核酸和氨基酸中親核基團(tuán)共價(jià)結(jié)合形成加合物,損傷生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能,可導(dǎo)致堿基突變、缺失、插入、交聯(lián)

3、、甚至是DNA斷裂等后果,這成為體細(xì)胞突變化學(xué)致癌機(jī)制的分子基礎(chǔ)。
　　 DNA修復(fù)基因是與腫瘤相關(guān)的首要環(huán)境應(yīng)答基因。核苷酸切除修復(fù)NER是DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)中最重要而靈活的一種,對(duì)多種DNA雙螺旋損傷變性,如多環(huán)芳烴、鉑類介導(dǎo)的DNA加合物,NER發(fā)揮主要的切除修復(fù)作用,而該通路的DNA修復(fù)酶多態(tài)將決定個(gè)體的DNA修復(fù)能力,成為腫瘤易感及化學(xué)治療個(gè)體差異的主要原因。
　　 核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(excisio

4、n repair cross complementation group 1,ERCC1)在NER過程中發(fā)揮著重要作用,位于19q13-3,ERCC1基因編碼的核蛋白,具有結(jié)構(gòu)特異性核酸內(nèi)切酶活性,在雙鏈DNA交界邊緣酶促5'裂解,以切除損傷的寡核苷酸。許多腫瘤病例對(duì)照研究和預(yù)后生存分析發(fā)現(xiàn)ERCC1基因多態(tài)性可影響NER系統(tǒng)的DNA損傷修復(fù)能力,與腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后治療關(guān)系密切。ERCC1基因存在著兩個(gè)常見的SNPs:一個(gè)位于118密

5、碼子的Asn118Asn(rs11615);另一個(gè)多態(tài)C8092A(rs3212986)位于ERCC13'非編碼區(qū)。近年來ERCC1基因多態(tài)性相關(guān)研究頗受關(guān)注,但迄今尚無明確結(jié)論,詳細(xì)機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。
　　 本研究以780例沈陽地區(qū)健康漢族人群為研究對(duì)象,通過高效液相色譜精確定量的體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞與BaP作用產(chǎn)生的BPDE-DNA加合物水平和改良彗星試驗(yàn)評(píng)價(jià)的BaP所致DNA損傷來衡量個(gè)體DNA損傷修復(fù)能力,同時(shí)檢測ERC

6、ClAsn118Asn(rs11615),C8092A(rs3212986)SNP位點(diǎn)基因型、單體型,并分析ERCC1及其相鄰基因CAST的表達(dá)水平,試圖探討環(huán)境致癌因子所致DNA損傷修復(fù)能力的個(gè)體差異與ERCC1基因多態(tài)及其表達(dá)的關(guān)聯(lián),找尋意義確切的腫瘤關(guān)聯(lián)性生物標(biāo)志,進(jìn)而試圖闡明基因.基因、基因-環(huán)境間的交互作用及其機(jī)制,為NER通路腫瘤關(guān)聯(lián)性生物標(biāo)志的研究提供科學(xué)依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1.研究對(duì)象的確定<

7、br>　　 從2010年10月至2011年5月,收集來自沈陽市第九人民醫(yī)院體檢中心的中國漢族成年健康人群780例,填寫簡單調(diào)查問卷:記錄人口學(xué)特征、既往病史、家族史及生活方式(吸煙、飲酒)等一般狀況。研究對(duì)象排除腫瘤、遺傳性疾病、放化療、重度感染等疾病。告知研究對(duì)象并簽署知情同意書后實(shí)施研究計(jì)劃。
　　 2.血液樣品采集
　　 每一研究對(duì)象平穩(wěn)采集8ml外周靜脈血樣:其中6ml抗凝用于外周血淋巴細(xì)胞分離;2ml抗凝用于

8、常規(guī)提取DNA。
　　 3.淋巴細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力的評(píng)定
　　 3.1BPDE-DNA加合物水平測定(高效液相色譜法);
　　 3.2BaP所致DNA損傷測定(改良彗星試驗(yàn))。
　　 4.ERCC1基因多態(tài)性的分析
　　 4.1TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR測定ERCC1 Asn118Asn(rs11615),C8092A(rS3212986)SNP位點(diǎn)基因型:
　　 4.2ERCC1 S

9、NP基因型在人群中的分布頻率;
　　 4.3ERCC1 SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡性分析,并確定單體型;
　　 4.4DNA修復(fù)能力與ERCC1候選SNP及單體型的關(guān)聯(lián)分析。
　　 5.ERCC1和CAST基因表達(dá)水平的分析
　　 5.1實(shí)時(shí)定量PCR測定BPDE染毒后ERCC1 mRNA表達(dá)水平;
　　 5.2實(shí)時(shí)定量PCR測定BPDE染毒后CAST mRNA表達(dá)水平;
　　 5.3分析個(gè)體

10、DNA損傷修復(fù)能力與ERCC1、CAST基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)。
　　 6.BPDE-DNA加合物損傷修復(fù)的多因素分析
　　 結(jié)果：
　　 1.ERCC1基因多態(tài)在人群中的分布頻率及單體型分析
　　 ERCC1 C19007T和C8092A兩個(gè)SNP位點(diǎn)存在明顯的連鎖不平衡(D'=0.940,R2=0.134)。同時(shí)兩者的基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律。
　　 2.HPLC檢測淋巴細(xì)胞B

11、PDE-DNA加合物水平的相關(guān)分析
　　 2.1BPDE-DNA加合物含量與性別、年齡、飲酒、吸煙情況之間的關(guān)系50-69歲和≥70歲年齡組人群淋巴細(xì)胞中BPDE-DNA加合物含量升高,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與無飲酒吸煙史(飲酒指數(shù)或吸煙指數(shù)為1)的人群相比,飲酒指數(shù)不小于100的人群BPDE-DNA加合物含量明顯升高,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨吸煙指數(shù)的增加,加合物含量有所上升,但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<

12、br>　　 2.2BPDE-DNA加合物含量與ERCC1 C19007T、C8092A基因多態(tài)及單體型之間的關(guān)系
　　 ERCC1 C8092ACA與AA基因型與CC野生型比較,人群外周血淋巴細(xì)胞中BPDE-DNA加合物含量升高,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)而ERCC1 C19007TCT、TT基因型與CC野生型比較,BPDE-DNA加合物含量無明顯變化。與C/C單體型比較,C/A單體型中ORa值為1.888(95%CI

13、1.466-2.432),且其他人數(shù)分布頻率小于5%的單體型也有較高的ORa值(ORa=2.00895%CI1456-2.769)。
　　 2.3BPDE-DNA加合物含量的多因素分析
　　 高水平BPDE-DNA加合物的風(fēng)險(xiǎn)與年齡、飲酒指數(shù)及ERCC1C8092AA等位基因相關(guān)聯(lián),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),其中,ERCC1 C8092AA等位基因突變對(duì)高水平BPDE-DNA加合物的影響程度最大,貢獻(xiàn)度為42.8

14、%。
　　 3.改良彗星實(shí)驗(yàn)檢測BaP所致淋巴細(xì)胞DNA損傷的相關(guān)分析
　　 3.1彗星尾距(尾面積)比值與性別、年齡、飲酒、吸煙情況之間的關(guān)系50-69歲和≥70歲年齡組人群與對(duì)照組(＜30歲)比較,尾距比值與尾部面積比值均升高,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。性別、飲酒指數(shù)和吸煙指數(shù)對(duì)彗星尾距比值和尾部面積比值影響均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.2彗星尾距(尾面積)比值與ERCC1 C19007T、C8092

15、A基因多態(tài)之間的關(guān)系
　　 與ERCC1 C8092ACC野生型比較,CA與AA基因型彗星尾距比值與尾部面積比值明顯升高,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ERCC1 C19007T基因多態(tài)對(duì)彗星尾距比值和尾部面積比值的影響均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.3彗星尾距(尾面積)比值的多因素分析
　　 ERCC1 C8092AA等位基因突變與彗星實(shí)驗(yàn)尾距比值和尾部面積比值在所有因素中的影響程度最大,貢獻(xiàn)度分別為37.

16、4%和22.7%。
　　 3.4BaP所致DNA損傷綜合評(píng)分與ERCC1 C8092A多態(tài)的關(guān)聯(lián)
　　 ERCC1 C8092ACC、CA與AA基因型DNA損傷評(píng)分分別為46.19、72.76和104.7。隨A等位基因的增加,DNA損傷程度明顯加大,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 4.BPDE處理后ERCC1及CAST mRNA表達(dá)水平與ERCC1基因多態(tài)的關(guān)聯(lián)
　　 C8092AAA基因型C

17、AST mRNA表達(dá)水平明顯低于C8092ACC野生型(P＜0.05)。而ERCC1 mRNA表達(dá)水平染毒后各基因型之間無明顯差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.ERCC1 C8092AA等位基因可增加高水平BPDE-DNA加合物的風(fēng)險(xiǎn)、與苯并(a)芘所致DNA損傷修復(fù)能力降低相關(guān)聯(lián)。
　　 2.ERCC1 C8092A多態(tài)可能通過影響個(gè)體DNA損傷修復(fù)效率,而成為一個(gè)意義確切的與環(huán)境致癌因子相關(guān)的腫瘤易感性生物標(biāo)志