基于轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型研究ERCC2-XPD基因多態(tài)與苯并[a]芘所致DNA損傷修復(fù)的關(guān)聯(lián).pdf

1、前言:
　　 苯并[a]芘(benzo[a]pyrene，B[a]P)是多環(huán)芳烴(Polycylic AromaticHydrocarbons，PAHs)類化合物的典型代表，廣泛存在于生產(chǎn)和生活環(huán)境中，主要在有機(jī)物如燃煤、燃?xì)?、煉焦、垃圾焚燒等的高溫裂解過程中產(chǎn)生，其進(jìn)入機(jī)體后經(jīng)肝微粒體酶活化系統(tǒng)，形成終致癌產(chǎn)物反式二氫二醇環(huán)氧苯并[a]芘(7，8-dihydrodiol9，10-epoxide benzo[a]pyrene，B

2、PDE)，能與DNA結(jié)合形成加合物，在代謝過程中產(chǎn)生的大量活性氧(ROS)也可造成DNA的損傷，從而誘發(fā)皮膚癌、肺癌、直腸癌、胃癌、膀胱癌等多種癌癥。
　　 腫瘤是細(xì)胞分化、增殖和死亡機(jī)制發(fā)生異常的結(jié)果。DNA的損傷和基因結(jié)構(gòu)的異常以及由此造成的癌基因和抑癌基因表達(dá)或功能上的改變是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的必要前提。人類細(xì)胞基因組DNA受到損傷后，首先通過對損傷的感知和識別，經(jīng)過某種信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生以下效應(yīng):DNA修復(fù)，旁路復(fù)制(trans

3、lesion replication)以及凋亡(apoptosis)。研究表明DNA損傷修復(fù)能力的個體差異是決定腫瘤易感性的重要因素，而個體DNA損傷修復(fù)能力與DNA修復(fù)基因的單核苷酸多態(tài)(Singlenucleotide polymorphisms，SNP)密切相關(guān)。核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因2，又稱著色性干皮病基因D(Excision repair cross complementation group2/xerodermapigm

4、entosum group D，ERCC2/XPD)位于人類染色體19q13.3，是一種進(jìn)化保守的ATP依賴性DNA解旋酶，在NER途徑中起著重要作用。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)ERCC2/XPD的編碼區(qū)存在6個SNPs位點，分別為密碼子156 C→A、199 C→T、201 C→T、312 G→A、711 C→T、751 A→C，其中751位點的多態(tài)性與腫瘤發(fā)生的易感性是近幾年來流行病學(xué)研究的熱點。
　　 ERCC2/XPD751位點的A→C堿

5、基突變導(dǎo)致相應(yīng)的Lys→Gln氨基酸的改變。該密碼子位于ERCC2/XPD蛋白N端，保守性差。有研究顯示，攜帶ERCC2/XPD751Gln變異等位基因的個體NER能力明顯下降，且密碼子751位點野生型純合子個體的DNA修復(fù)能力高于雜合子和突變型純合子的個體，提示ERCC2/XPD基因密碼子751位點的突變與DNA損傷修復(fù)能力密切相關(guān)，從而影響個體對多種腫瘤的遺傳易感性。但以人群為基礎(chǔ)的流行病學(xué)研究結(jié)果存在的不一致性，提示我們需要標(biāo)化研

6、究環(huán)境因素的暴露，以探討基因-環(huán)境間的交互作用。
　　 本研究通過構(gòu)建ERCC2/XPD Lys751 Gln(rs13181)位點不同基因型的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)突變型UV5(ERCC2/XPD表達(dá)缺失)，獲得穩(wěn)定表達(dá)ERCC2/XPD Lys751 Gln(rs13181)位點不同基因型的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，明確施加環(huán)境致癌因子苯并[a]芘后，比較ERCC2/XPD Lys751 Gln(rs13181)位點不同基因

7、型DNA損傷修復(fù)能力的差異以及對ERCC2/XPD轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達(dá)水平的影響，與前期人群研究結(jié)果相結(jié)合，試圖為找尋意義明確的環(huán)境致癌因子相關(guān)腫瘤的遺傳易感性生物標(biāo)志提供理論依據(jù)。
　　 研究方法:
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)及處理
　　 中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO) AA8(CHO野生型)、UV5(CHO突變型，ERCC2/XPD表達(dá)缺失)用含10％ FBS、10 IU/ml青霉素、10 IU/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基

8、，置于37℃，5％ CO2孵育箱中培養(yǎng)。用不同濃度B[a]P處理，并加入S9混合液（體積比為3％）。B[a]P溶于DMSO中，各組DMSO的終濃度均低于0.1％。S9混合液的組分包括:S9（體積分?jǐn)?shù)為10％）、33 mmol KCl、8mmolMgCl2·6H2O、5 mmol6-磷酸葡萄糖(G-6-P，C6H11O9PNa2)、4mmol NADP(輔酶Ⅱ)、0.1 mol Na2HPO4～NaH2PO4(pH7.4)。
　　

9、 2、體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的構(gòu)建
　　 2.1 Gateway定向克隆法構(gòu)建包含ERCC2/XPD Lys751 Gln(rs13181)位點不同基因型的質(zhì)粒由荷蘭萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)研究中心完成，并饋贈本課題組。
　　 2.2采用invitrogen Lipofectamine~2000轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)突變型UV5(ERCC2/XPD表達(dá)缺失)，獲得穩(wěn)定表達(dá)ERCC2/XPDLys751Gln(rs1318

10、1)位點不同基因型的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。
　　 2.3轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的鑒定:Western blotting檢測ERCC2/XPD基因蛋白表達(dá)、TaqMan(㊣) real-time PCR法檢測ERCC2/XPD Lys751Gln(rs13181)位點基因型。
　　 3、各細(xì)胞系DNA損傷修復(fù)能力的檢測
　　 3.1細(xì)胞抑制率實驗(MTT)測定B[a]P處理后細(xì)胞存活率;
　　 3.2彗星實驗和Rad51免疫熒光

11、實驗測定B[a]P所致DNA的損傷情況;
　　 3.3各細(xì)胞系DNA損傷修復(fù)能力差異的比較。
　　 4、ERCC2/XPD Lys751Gln(rs13181) SNP功能差異的可能機(jī)制
　　 4.1 Real-time PCR測定B[a]P染毒后ERCC2/XPD mRNA水平;
　　 4.2 Western blotting測定B[a]P染毒后ERCC2/XPD蛋白表達(dá)水平;
　　 4.3在轉(zhuǎn)

12、錄和蛋白水平上分析比較表達(dá)ERCC2/XPD Lys751Gln(rs13181)位點不同基因型的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系之間的差異。
　　 結(jié)果:
　　 1、體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型構(gòu)建成功
　　 1.1 ERCC2/XPD rs13181 AA(Lys751)、rs13181 CC(Gln751)和GFP質(zhì)粒分別同時轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli DH5α)，可選擇生長于含卡那霉素的LB瓊脂平板。對提純的質(zhì)粒進(jìn)行測序，ERCC2

13、/XPD序列正確無誤。
　　 1.2 ERCC2/XPD rs13181 AA(Lys751)、rs13181 CC(Gln751)和GFP質(zhì)粒分別同時轉(zhuǎn)染UV5細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞可在含0.5-1 mg/ml G418的DMEM培養(yǎng)基中選擇性生長。五日后，熒光顯微鏡下可見表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到80％以上。
　　 1.3 Western blot鑒定ERCC2/XPD基因在各細(xì)胞中的表達(dá)，兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞UV5

14、ERCC2(AA)和UV5ERCC2(CC)可表達(dá)分子量為87 kD的ERCC2/XPD蛋白，證實細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。
　　 1.4 TaqMan(㊣) real-time PCR法驗證轉(zhuǎn)染細(xì)胞UV5ERCC2(AA)和UV5ERCC2(CC)的ERCC2/XPD Lys751Gln(rs13181)位點不同基因型，分別為AA和CC。
　　 2、各細(xì)胞系DNA損傷修復(fù)能力差異的比較
　　 2.1 MTT實驗結(jié)果顯示ER

15、CC2/XPD缺失型細(xì)胞(UV5和UV5GFP)與野生型AA8相比，對B[a]P表現(xiàn)出較強(qiáng)的敏感性。而ERCC2/XPD過表達(dá)轉(zhuǎn)染細(xì)胞則表現(xiàn)出與AA8相似的細(xì)胞抑制率。對于轉(zhuǎn)染細(xì)胞UV5ERCC2(AA)和UV5ERCC2(CC)在B[a]P處理24 h時，各濃度的細(xì)胞存活率并無明顯的差異，但是經(jīng)過24 h的恢復(fù)，5、10、25、50μM B[a]P處理時UV5ERCC2(CC)的細(xì)胞存活率明顯低于UV5ERCC2(AA)，差異有統(tǒng)計學(xué)

16、意義(P＜0.05)。
　　 2.2彗星實驗結(jié)果顯示ERCC2/XPD過表達(dá)可以使DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)。在B[a]P處理6h和12h時，除10μM B[a]P處理6h外，兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(方差分析，LSD，P＜0.05)，說明不同基因型在BPDE-DNA加合物形成的高峰期，對DNA損傷修復(fù)能力是有影響的。
　　 2.3 Rad51免疫熒光實驗FOCI不僅代表著DNA損傷中心，還是同源重組(homologo

17、us recombination，HR)啟動的標(biāo)志之一。結(jié)果同樣驗證了ERCC2/XPD過表達(dá)可以使DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)。但是兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞間FOCI的數(shù)量并無顯著性差異。
　　 3、ERCC2/XPD Lys751 Gln(rs13181) SNP功能差異的機(jī)制探討
　　 3.1 Real-time PCR實驗結(jié)果顯示B[a]P處理6h時，ERCC2/XPD的mRNA水平達(dá)到高峰，隨著染毒時間的延長，ERCC2/XPD

18、的mRNA水平逐漸呈下降趨勢。在5μM B[a]P處理12h時，UV5ERCC2(AA)的ERCC2/XPD mRNA表達(dá)水平明顯高于UV5 ERCC2(CC)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 3.2 Western blot實驗結(jié)果顯示B[a]P處理6h時，ERCC2/XPD的蛋白表達(dá)水平達(dá)到峰值并且持續(xù)到12 h。在5μM B[a]P處理12 h時，UV5ERCC2(AA)的ERCC2/XPD蛋白表達(dá)水平明顯高于U

19、V5ERCC2(CC)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、本研究通過獲得穩(wěn)定表達(dá)ERCC2/XPD Lys751 Gln(rs13181)位點不同基因型的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，為體外研究ERCC2/XPD基因多態(tài)構(gòu)建了實驗技術(shù)平臺。
　　 2、本研究發(fā)現(xiàn)ERCC2/XPD Lys751Gln(rs13181) SNP在苯并[a]芘所致DNA損傷修復(fù)能力方面存在差異，該位點AA基因型轉(zhuǎn)染細(xì)胞的損傷修