VEGF及BMP2基因修飾對血管化組織工程骨的影響及機制研究.pdf

1、頜面部骨缺損常見于腫瘤切除、頜骨骨髓炎術后及頜面部外傷等疾患，近年來，我國由上述原因導致的骨缺損患者數(shù)量呈逐年上升趨勢。揭示骨缺損修復的機制，尋找骨缺損良好修復的方法是骨缺損修復研究領域亟待解決的關鍵問題。早期的自體骨移植、異體骨移植等傳統(tǒng)修復骨缺損的方法對機體損傷較大且效果不佳;之后人工合成的骨替代物因生物相容性差、體內降解慢及機械性能低等不足沒有廣泛推廣;近些年骨組織工程骨的出現(xiàn)為頜骨缺損的修復帶來新希望。骨組織工程技術改變了以往創(chuàng)

2、傷性修復的模式，以少量組織細胞修復大面積組織缺損，并可根據(jù)需要進行塑形恢復缺損形態(tài)，為實現(xiàn)無創(chuàng)修復及良好的生物功能重建提供了理論基礎為骨再生修復指明了新的方向。骨組織工程主要包括種子細胞、生長因子及載體支架三個要素。種子細胞是骨組織工程的首要環(huán)節(jié)和基本要素，其目的是使所構建的組織工程骨兼具骨傳導性及骨誘導性，從而更好的修復骨缺損。所以選擇最優(yōu)的種子細胞成為骨組織工程首要解決的問題。骨髓基質干細胞(Bonemarrowstromalcel

3、ls，BMSCs)具有較強的多向分化能力，在一定條件下可分化為骨、軟骨、脂肪等細胞，BMSCs也因此成為骨組織工程中應用最廣泛的種子細胞。骨形成蛋白2(Bonemorphogeneticprotein2，BMP2)具有較強的誘導骨形成能力，將因子直接應用于體內由于彌散作用及其半衰期短的原因成骨效果不佳。研究發(fā)現(xiàn)采用基因修飾的方式可彌補因子直接應用的不足，所以將BMP2與BMSCs聯(lián)合應用的方法可為骨組織工程提供新型種子細胞。
　　

4、 以種子細胞復合生物材料的方法修復骨缺損雖然取得了一定的成功，但一些較大面積的骨缺損因植入物缺少充足的血供而發(fā)生壞死。因此，有效的血管化已與種子細胞、支架材料及生長因子共同列入骨組織工程的重要因素。預成血管植入是使骨替代物血管化最直接有效的方法，即將血管預先植入骨替代物中，利用顯微外科技術將其與宿主體內血管吻合。此種方法可建造獨立的血管系統(tǒng)，為植入物提供豐富的血供，可達到良好的血管化效果。但是由于經(jīng)歷多次手術、損傷供血管區(qū)及治療周期長

5、等不足使此方法局限于小面積骨缺損及軟組織創(chuàng)傷的修復;誘導血管生成的因子如血管內皮生長因子(VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF)、成纖維細胞生長因子(Fibroblastgrowthfactor，F(xiàn)GF)、血管緊張素(Angiopoietin，Ang)的使用可促進血管生成，但因半衰期短局部直接應用效果欠佳。目前將具有血管形成能力的細胞與成骨性細胞的聯(lián)合應用是血管化組織工程骨最有前景的方法之一，尤為血管

6、內皮前體細胞(EndothelialProgenitorCells，EPCs)的出現(xiàn)，證明血管發(fā)生也存在于發(fā)育成熟后的機體組織打破了血管形成的傳統(tǒng)理念，為缺血性疾病提供了新思路。EPCs是一種未成熟細胞，可分化為內皮細胞直接參與血管形成，在后肢缺血、心肌缺血及角膜損傷等動物模型的實驗研究中取得了一定的成功。但EPCs的細胞數(shù)量有限，不足以用于大面積缺血缺損的修復。VEGF基因修飾EPCs可彌補其數(shù)量不足的缺點，因為VEGF不僅可以募集、

7、趨化EPCs至缺損處，其本身也可直接誘導血管生成。因此，VEGF與EPCs聯(lián)合應用應該能夠達到事半功倍的效果。基于此，本實驗選擇具有血管形成能力的細胞與成骨性細胞聯(lián)合應用的方法促進組織工程骨血管化，觀察血管及骨形成情況，探討VEGF-EPC與BMP2-BMSC聯(lián)合應用對血管化及成骨作用的影響。
　　 主要實驗方法及結果:
　　 1.BMSCs的分離及鑒定:將密度梯度離心法分離的大鼠骨髓單個核細胞通過塑料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)、體外擴

8、增傳代進行分離純化獲得較高純度的BMSCs。分別將BMSCs培養(yǎng)于成骨誘導液及成脂誘導液中，茜素紅染色及油紅O染色證明BMSCs可誘導分化為成骨細胞、成脂肪細胞，通過細胞功能檢測鑒定培養(yǎng)的細胞為BMSCs。
　　 2.EPCs的分離及鑒定:采用密度梯度離心法分離大鼠骨髓的單個核細胞，通過特殊培養(yǎng)基誘導，貼壁培養(yǎng)、體外擴增純化獲取細胞，利用細胞形態(tài)學、細胞表型檢測及細胞免疫雙熒光、體外成管實驗等細胞功能檢測進行鑒定，結果證實此種方

9、法分離誘導純化的細胞為EPCs。同時將BMSCs及EPCs以不同比例混合培養(yǎng)，MTT法檢測細胞的增殖能力，確定BMSCs∶EPCs的最佳混合比例為1∶1。
　　 3.Ad-BMP2及Ad-VEGF腺病毒載體的構建及有效性鑒定:體外構建Ad-BMP2及Ad-VEGF腺病毒載體，利用AdMax包裝系統(tǒng)對其包裝、純化，鑒定重組病毒載體攜帶目的基因的正確性。
　　 3.1.測定Ad-BMP2的滴度為2.3×1011pfu/ml，

10、Ad-VEGF滴度為3×1011pfu/ml;設置MOI梯度將Ad-BMP2、Ad-VEGF分別轉染BMSCs、EPCs，通過對綠色熒光表達的觀察確定病毒轉染的最佳MOI值為40，并繪制細胞生長曲線證明在MOI=40時細胞的增殖能力沒有受到影響;
　　 3.2.提取重組腺病毒轉染組、空白病毒轉染組及空白細胞組的RNA，實時定量PCR檢測顯示在RNA水平Ad-BMP2-BMSCs組BMP2及Ad-VEGF-EPCs組VEGF的表達

11、顯著高于各自對照組(p＜0.05);分別收集各組細胞上清，Elisa檢測BMP2、VEGF蛋白水平的表達，Ad-BMP2-BMSCs組BMP2及Ad-VEGF-EPCs組VEGF的表達顯著高于各自對照組(p＜0.05);證明了Ad-BMP2及Ad-VEGF腺病毒載體構建的有效性。
　　 4.VEGF修飾的EPCs對BMP2-BMSC體外成骨分化的影響:將細胞分為BMSC+EPC、Ad-BMP2-BMSC+EPC、BMSC+Ad-

12、VEGF-EPC及Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC四組，體外行成骨誘導培養(yǎng)，分別于7d、14d、21d及28d行成骨能力檢測。
　　 4.1茜素紅染色觀察礦化結節(jié):結果顯示各組礦化結節(jié)數(shù)目隨時間增加而增多，在第21d及28d，BMP2轉染組Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC及Ad-BMP2-BMSC+EPC礦化結節(jié)數(shù)目顯著高于其他組（p＜0.05）;兩組的礦化結節(jié)數(shù)目在21、28天的變化不明顯;

13、r>　　 4.2ALP活性檢測:隨時間增加每組細胞的ALP活性逐漸增強，誘導后第21天各組ALP活性均達最高值，且BMP2轉染組Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC及Ad-BMP2-BMSC+EPC的ALP活性顯著高于其他組(p＜0.05);但在第28天發(fā)現(xiàn)各組間的差異減小，且Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC及Ad-BMP2-BMSC+EPC的ALP活性較21d變化微小;
　　 4.3實時定量PCR

14、檢測ALP、OC、ColⅠ成骨基因表達:Ad-BMP2-BMSC+EPC、BMSC+Ad-VEGF-EPC及Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC組中ALP基因的表達在誘導后第21天達到高峰，其中Ad-BMP2-BMSC+EPC組和Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC組ALP的表達顯著高于其他各組(P＜0.05)，每組的OC表達隨時間變化增長緩慢，組間沒有顯著差異;隨時間變化各組的ColⅠ表達逐漸增多，21天時達到

15、高點，且Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC組ColⅠ表達水平高于其他各組（P＜0.05）。
　　 5.VEGF修飾的EPCs對組織工程骨形成及血管化的影響:將BMSC+EPC、Ad-BMP2-BMSC+EPC、BMSC+Ad-VEGF-EPC及Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC四組細胞分別與藻酸鹽凝膠混合注入大鼠股骨外側肌袋內，每組5只大鼠，分別于4w及6w將動物處死取出植入組織，免疫染色檢測骨、Co

16、lⅠ及血管形成。
　　 5.1石蠟包埋后切片行HE染色檢測新生組織中骨生成情況，結果顯示混合物注入4周后組織切片HE染色可見藻酸鹽凝膠材料數(shù)量減少，長圓形、梭形細胞圍繞凝膠材料周圍;第6周，HE染色仍可觀察到材料的殘余，能夠見到細胞核深染的成骨細胞形成。實驗中未見有炎癥反應發(fā)生。定量分析骨形成面積:在第4周和第6周，Ad-BMP2-BMSC+EPC及Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC組新骨形成面積顯著高于其他兩組(

17、P＜0.05）;第6周，Ad-BMP2-BMSC+EPC及Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC組組間有顯著差異（P＜0.05），但Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC及Ad-BMP2-BMSC+EPC組新骨形成面積相對第4周增長緩慢;
　　 5.2天狼猩紅染色檢測ColⅠ生成情況:可觀察到新膠原組織產(chǎn)生，并間雜有不規(guī)則狀的未成熟骨樣基質。隨時間增長，新生膠原組織數(shù)量增加。第4及第6周，Ad-BMP2-BM

18、SC+EPC及Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC組新膠原形成面積顯著高于其他兩組（P＜0.05）;
　　 5.3血管內皮特殊標記物CD31檢測新生物中血管的生成情況，第4及第6周，BMSC+Ad-VEGF-EPC及Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC兩組血管生成數(shù)目顯著高于其他兩組(P＜0.05)，且兩組間存在顯著差異Ad-BMP2-BMSC+Ad-VEGF-EPC組的血管生成數(shù)量顯著高于BMSC+Ad

19、-VEGF-EPC組(P＜0.05)。
　　 6.BMP2及VEGF對Id1表達的影響:分別提取Ad-BMP2-BMSC組、Ad-VEGF-EPC組、空白病毒轉染細胞組及空白細胞組的RNA，實時定量PCR檢測Ad-BMP2-BMSC組及Ad-VEGF-EPC組Id1基因RNA水平的表達顯著高于各自對照組（P＜0.05）。
　　 結論:
　　 1.密度梯度離心法分離大鼠骨髓單個核細胞，通過不同的誘導方式對其進行分離

20、、誘導及純化可分別得到純度較好的BMSCs及EPCs。
　　 2.通過細胞功能鑒定證明EPCs具有血管形成能力及BMSCs具有成骨分化能力。
　　 3.體外構建Ad-BMP2及Ad-VEGF重組腺病毒表達載體，滴度高轉染效率好，可使BMSCs過表達BMP2及EPCs高表達VEGF，可有效促進BMSCs的成骨性能及EPCs的血管形成活性。
　　 4.VEGF修飾的EPCs與BMP2修飾的BMSCs聯(lián)合應用，可通過細

21、胞間因子交流有效促進血管的形成，VEGF修飾的EPCs為理想的促血管生成種子細胞。
　　 5.BMP2及VEGF誘導Id1的表達升高對成骨細胞終末分化的抑制作用可能會導致骨形成不佳，且Id1可通過募集趨化EPCs促進血管生成;由此推測Id1可能為成骨分化及血管形成的重要分子。Id1在骨形成及血管形成中的作用為骨組織工程的研究提供了新思路。
　　 創(chuàng)新性和意義:
　　 1.本研究的創(chuàng)新點是在國內外首次將BMP修飾的