我國常見粉蚧類害蟲雙基因條形碼鑒定技術(shù)研究.pdf

1、粉蚧屬半翅目Hemiptera、粉蚧科Pseudococcidae，是一類重要的世界性檢疫性害蟲。粉蚧類害蟲種類繁多，已知種類2000余種；且體形微小、形態(tài)多樣、寄主范圍廣、隱蔽性強(qiáng)，極易隨國際貿(mào)易活動(dòng)傳播擴(kuò)散，給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大威脅。通常，口岸截獲的粉蚧多為若蟲或殘?bào)w，加之隱存種/復(fù)合種的存在和較小的近緣種間差異，嚴(yán)重影響了基于形態(tài)學(xué)特征的粉蚧類害蟲識(shí)別鑒定的準(zhǔn)確性和時(shí)效性。本研究以線粒體COI基因和核糖體28S rRNA為靶標(biāo)，

2、研究探討了雙基因DNA條形碼在粉蚧鑒定中的作用，評(píng)價(jià)了該技術(shù)對(duì)重大潛在入侵害蟲大洋臀紋粉蚧的鑒定有效性；同時(shí)，針對(duì)重大檢疫性害蟲木薯綿粉蚧研發(fā)出了其種特異性檢測(cè)鑒定技術(shù)體系。具體研究結(jié)果如下：
　?。?）粉蚧類昆蟲全基因組DNA提取方法的評(píng)價(jià)研究。以雌性成蟲、卵、各齡期若蟲等為對(duì)象，分析比較了8種DNA提取方法，明確了SDS法最適于粉蚧類害蟲高齡若蟲和雌成蟲DNA提取，DeBarro法適于卵和低齡若蟲DNA提取，有效解決了粉蚧類害

3、蟲體表蠟質(zhì)較厚，DNA得率不高的難題。
　?。?）雙基因條形碼技術(shù)在我國常見粉蚧鑒定中的應(yīng)用。以來自國外11個(gè)種群、國內(nèi)93個(gè)種群的9屬22種粉蚧461個(gè)個(gè)體為對(duì)象，以COI基因5’端和28S基因D2-D3區(qū)段為靶標(biāo)，通過堿基序列測(cè)定和分析，以及種內(nèi)種間遺傳距離計(jì)算，并同時(shí)整合數(shù)據(jù)庫中高質(zhì)量的相關(guān)種的靶標(biāo)序列，分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，22種粉蚧的COI基因5’端序列具有48個(gè)單倍型，而28S基因D2-D3序列則具有33個(gè)單倍

4、型。當(dāng)以COI基因5’端序列為靶標(biāo)時(shí)，22種粉蚧的種內(nèi)遺傳距離為0.0000~0.0160，平均為0.0034；種間遺傳距離均大于2％，為0.0220~0.1780，平均為0.0921；種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的27.1倍；且種內(nèi)遺傳距離與種間遺傳距離之間不存在重疊區(qū)域。在基于COI-5’序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，各物種均具有獨(dú)立的進(jìn)化分支。當(dāng)以28S基因D2-D3區(qū)段為靶標(biāo)時(shí)，部分屬內(nèi)十分保守，種內(nèi)遺傳距離與種間遺傳距離之間存在重疊現(xiàn)

5、象，不能對(duì)部分近緣種進(jìn)行有效區(qū)分；而屬間變異相對(duì)較大。同時(shí)，研究還顯示，大洋臀紋粉蚧和柑橘臀紋粉蚧可能存在隱存種或復(fù)合種；而粉蚧屬可能存在多起源現(xiàn)象。進(jìn)而表明，COI基因較28S基因更適合于種間的物種鑒定；而COI基因和28S基因的聯(lián)合應(yīng)用，有利于提高DNA條形碼技術(shù)對(duì)粉蚧類害蟲的鑒定能力，實(shí)現(xiàn)對(duì)粉蚧類害蟲的準(zhǔn)確識(shí)別與鑒定。
　?。?）DNA條形碼技術(shù)對(duì)近緣種粉蚧-重大潛在入侵害蟲大洋臀紋粉蚧和土著種柑橘臀紋粉蚧的鑒定有效性研究。

6、以旅檢截獲的36頭大洋臀紋粉蚧為對(duì)象、其近緣種柑橘臀紋粉蚧為參照，序列分析表明，當(dāng)分別以 COI基因5’端和3’端序列為靶標(biāo)時(shí)，截獲大洋臀紋粉蚧的堿基序列與數(shù)據(jù)庫中靶標(biāo)種的序列相似性分別為100%和99~100%，而與近緣種柑橘臀紋粉蚧的相似性分別為97~98%和96~98%；且大洋臀紋粉蚧和柑橘臀紋粉蚧分別存在5個(gè)和12個(gè)穩(wěn)定的物種特異性鑒別位點(diǎn)；系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，截獲的大洋臀紋粉蚧均與數(shù)據(jù)庫中的靶標(biāo)種聚為一支。當(dāng)以28S基因D2-D

7、3區(qū)段序列為靶標(biāo)時(shí)，臀紋粉蚧屬各物種間高度保守，無法區(qū)分大洋臀紋粉蚧與其近緣種柑橘臀紋粉蚧；種間遺傳距離僅為0.004。此外，進(jìn)一步的物種識(shí)別軟件評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，基于COI基因5’端和3’端序列的鑒定結(jié)果完全正確，而基于28S基因D2-D3區(qū)段序列的鑒定結(jié)果卻存在45.2~61.9%的模糊鑒定。表明，基于COI基因5’端和3’端的DNA條形碼技術(shù)完全可用于大洋臀紋粉蚧的準(zhǔn)確鑒定及檢測(cè)監(jiān)測(cè)，對(duì)有效阻截其入侵和進(jìn)一步擴(kuò)散蔓延意義重大。

8、　?。?）重大潛在入侵害蟲木薯綿粉蚧的快速PCR檢測(cè)技術(shù)研究?；跍y(cè)序獲得的COI基因5’端序列，設(shè)計(jì)木薯綿粉蚧的種特異性SS-COI引物1對(duì)(PMSSZW-1F/PMSSZW-1R)，其擴(kuò)增片段大小為353 bp；以我國口岸經(jīng)常截獲的扶桑綿粉蚧等8種粉蚧為參照，研究驗(yàn)證該引物對(duì)的種特異性，以及檢測(cè)靈敏性和檢測(cè)閾值。結(jié)果顯示，該引物對(duì)只對(duì)木薯綿粉蚧具有擴(kuò)增能力，對(duì)我國口岸經(jīng)常截獲的其他8種粉蚧不具擴(kuò)增效果；同時(shí)，對(duì)不同蟲態(tài)、齡期、成蟲殘

9、體以及來自不同寄主植物的木薯綿粉蚧亦具良好的擴(kuò)增效果，其最低檢出閾值為135.22±10.41 pg/μL(相當(dāng)于1/20480頭雌性成蟲)。木薯綿粉蚧的種特異性快速檢測(cè)技術(shù)具有快速、可靠、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)，能大大提高口岸檢驗(yàn)檢疫效率，該技術(shù)體系的建立為木薯綿粉蚧的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)與有效阻截提供了技術(shù)支撐，對(duì)保障我國木薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。
　　本研究圍繞粉蚧科昆蟲種類多、體形小、存在多型、多態(tài)，對(duì)農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)威脅巨大，卻難以快速