印楝素作用靶標(biāo)蛋白的篩選和驗(yàn)證.pdf

1、印楝素作為優(yōu)秀的植物源農(nóng)藥之一，具有廣譜的殺蟲(chóng)活性，以及低毒、低抗性、低殘留的特點(diǎn)，有廣泛的應(yīng)用前景和開(kāi)發(fā)潛力。印楝素的殺蟲(chóng)機(jī)制主要表現(xiàn)為拒食作用和調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育，但到目前為止印楝素的作用靶標(biāo)蛋白尚不明確。
　　為了尋找和驗(yàn)證印楝素的靶標(biāo)蛋白，從分子水平揭示印楝素的作用機(jī)制，本文以哺乳動(dòng)物細(xì)胞系為研究對(duì)象，以昆蟲(chóng)細(xì)胞系作為參照體系，通過(guò)檢測(cè)印楝素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響，檢測(cè)生長(zhǎng)因子受體激動(dòng)劑和PI3K抑制劑與印楝素協(xié)同作用，研究印楝素

2、與生長(zhǎng)因子受體和PI3K的關(guān)系，篩選PI3K/Akt信號(hào)通路上可能的作用靶標(biāo)。通過(guò)基因工程技術(shù)重組篩選到的可能作用靶標(biāo)蛋白，利用熒光光譜淬滅法和等離子共振法體外研究印楝素與目標(biāo)蛋白的結(jié)合，分析印楝素的作用模式。在此基礎(chǔ)上，解析印楝素抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的作用機(jī)制。
　　主要結(jié)果如下：
　　1.根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度和印楝素的抑制程度，從11種細(xì)胞系中篩選出人口腔上皮癌KB細(xì)胞株，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3，人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H12

3、993種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞系SL-1。檢測(cè)不同濃度印楝素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響，3μg/mL、12μg/mL、48μg/mL、192μg/mL工作濃度，在4種細(xì)胞系中具有明顯的細(xì)胞毒性和抑制生長(zhǎng)增殖的活性，抑制率與印楝素濃度成正比。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，為后續(xù)的試驗(yàn)選取了低濃度組3μg/mL、12μg/mL作為后續(xù)試驗(yàn)工作濃度。
　　采用羅丹明123染料處理細(xì)胞檢測(cè)印楝素處理細(xì)胞后線粒體膜電位的變化。試驗(yàn)結(jié)果表明，在印楝素的

4、工作濃度處理組，與正常細(xì)胞對(duì)照組相比，檢測(cè)到膜電位的降低，證明印楝素處理的4種細(xì)胞作用機(jī)制涉及線粒體途徑。
　　2.利用反向?qū)臃治鲂盘?hào)通路PI3K/Akt信號(hào)通路上的重要蛋白與印楝素結(jié)合能力，根據(jù)打分和結(jié)合位點(diǎn)綜合評(píng)估，初步確定生長(zhǎng)因子及其受體和PI3K為可能的靶標(biāo)。外源添加生長(zhǎng)因子受體激動(dòng)劑FGF-2和EGF和PI3K抑制劑Wortmannin，通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖變化，研究印楝素與生長(zhǎng)因子受體、PI3K的關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果表明，生

5、長(zhǎng)因子受體激動(dòng)劑FGF-2促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，印楝素顯著的抑制外源FGF-2的促細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。在外源生長(zhǎng)因子最大促生長(zhǎng)濃度18.75ng/mL，印楝素工作濃度2μg/mL和3μg/mL，可抑制90％的促增殖作用。
　　3.基因工程重組FGFR-2胞外段。采用熒光淬滅試驗(yàn)和SPR兩種不同的方法在體外檢測(cè)印楝素與FGF-2和FGFR-2，分別證明了印楝素與FGFR2相互作用，以及印楝素抑制FGF-2和FGFR2的結(jié)合。SPR試驗(yàn)結(jié)果表

6、明，經(jīng)印楝素與分別與FGF2和FGFR2孵育后結(jié)合均有不同程度的下降，與印楝素濃度相關(guān)。印楝素與FGF-2孵育進(jìn)樣，在130nM濃度下，和260nM濃度下，印楝素處理組結(jié)合分別下降7%和35%。
　　在FGFR2與印楝素分別以1:1,1:1.5,1:2，的濃度比孵育時(shí)，測(cè)定的結(jié)合抑制率分別為14.04%，14.6%，57.9%。
　　4．利用分子模擬技術(shù)，以FGF2-FGFR2晶體結(jié)構(gòu)為模板通過(guò)分子對(duì)接軟件，建立印楝素與FG