與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)microRNA的篩選及其靶標(biāo)的驗證.pdf

1、真核細(xì)胞中大約三分之一的蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中完成折疊和一些加工過程。當(dāng)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)超過了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的承載能力，就會激活未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，來協(xié)調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的加工能力和進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)量。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和許多疾病狀態(tài)相關(guān)，如代謝性疾病、心血管疾病和神經(jīng)衰退性疾病。
　　 MicroRNA是一種內(nèi)源性的22個堿基左右大小的RNA分子，主要通過和mRNA的3端非

2、翻譯區(qū)的非完全互補(bǔ)性結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過程。MicroRNA參與多種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，其中的一些應(yīng)激反應(yīng)也影響到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，如缺氧、胰島素分泌和B細(xì)胞分化過程。本研究試圖發(fā)現(xiàn)參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程的MicroRNA，并進(jìn)一步探討這些MicroRNA在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的生物學(xué)功能。進(jìn)行了以下研究：
　　 1.基因芯片篩選與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)microRNA
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激刺激物衣霉素(Tm)處理HEK293細(xì)胞，8h收取樣品，用

3、microRNA基因芯片篩選表達(dá)量發(fā)生變化的microRNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有4種microRNA的表達(dá)量發(fā)生變化，其中miR-26a表達(dá)量下調(diào)，miR-148a，miR-181b和miR-30d表達(dá)量上調(diào)，但變化的幅度都不大。
　　 2.建立實時定量RT-PCR檢測microRNA的方法，驗證基因芯片結(jié)果
　　 建立實時定量RT-PCR檢測microRNA的方法，并通過檢測擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和產(chǎn)物熔解曲線驗證了這種方法的可靠性

4、。Tm處理HEK293細(xì)胞，24h內(nèi)選擇多個時間點實時定量RT-PCR檢測miR-26a，miR-148a，miR-181b和miR-30d的表達(dá)量，結(jié)果只發(fā)現(xiàn)miR-148a在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過程中表達(dá)量顯著上調(diào)，到24h時上調(diào)達(dá)到2倍。用不同濃度Tm刺激HEK293細(xì)胞，實時定量RT-PCR檢測miR-148a表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)miR-148a上調(diào)程度和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的程度正相關(guān)。
　　 3.miR-148a調(diào)控UPR相關(guān)基因PDIA3和

5、CNX
　　 用microRNA靶標(biāo)預(yù)測軟件預(yù)測miR-148a可能調(diào)控的UPR相關(guān)基因，包括GRP78、GRP94、HRD1、OS9、EDEM1、PDIA3和CNX七個基因。分別構(gòu)建這幾個基因的3'UTR雙熒光素酶報告質(zhì)粒。共轉(zhuǎn)染實驗顯示miR-148a的模擬物可以顯著抑制PDIA3和CNX報告質(zhì)粒的相對熒光值，而miR-148a的抑制劑可以上調(diào)PDIA3和CNX報告質(zhì)粒的相對熒光值。構(gòu)建PDIA33'UTR與miR-148a

6、相互作用的種子序列突變的報告質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染實驗證實突變后消除了miR-148a模擬物的抑制作用。說明miR-148a調(diào)控UPR相關(guān)基因PDIA3和CNX。
　　 4.miR-148a、PDIA3和CNX在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中的變化關(guān)系
　　 Tm刺激HEK293細(xì)胞24h，實時定量RT-PCR檢測miR-148a、PDIA3和CNX表達(dá)量變化，繪制表達(dá)量的動力學(xué)曲線。結(jié)果顯示在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中，3種基因的表達(dá)均緩慢上調(diào)，PDI