冰片對川芎嗪經(jīng)鼻腔吸收入腦及對鼻黏膜黏蛋白表達水平影響的研究.pdf

1、目的:
　　冰片能促進藥物經(jīng)鼻腔吸收入腦，但對其促吸收機制尚不明確，通過細胞實驗及動物實驗研究，評估冰片對川芎嗪經(jīng)鼻腔給藥的影響及冰片對鼻黏膜黏蛋白表達的影響，以探討冰片促進其他藥物吸收的可能機制是否與抑制黏蛋白的表達，延長藥物鼻腔滯留時間有關(guān)。
　　方法:
　　（一）動物實驗研究:以70只新西蘭兔為實驗研究對象，每組10只，分為A高劑量冰片+川芎嗪組;B中劑量冰片+川芎嗪組;C低劑量冰片+川芎嗪組;D溶劑+川芎嗪組;

2、E生理鹽水組+川芎嗪組;F生理鹽水組;G靜脈注射組。其中冰片高、中、低濃度分別為20、10、5mg/ml，各組川芎嗪濃度均為川芎嗪50 mg/ml，G組經(jīng)耳緣靜脈注射E組藥物。按照0.4ml/只，由腰麻導(dǎo)管經(jīng)兔一側(cè)鼻孔插入，精確定量滴入實驗藥物。在給藥后0.5、1、3、5、10、30 min通過經(jīng)顱鉆孔開窗置管法，定量、連續(xù)采集腦脊液。以高效液相法對腦脊液中川芎嗪的濃度進行比較。
　?。ǘ┘毎麑嶒炑芯?以人氣道黏液上皮癌細胞系N

3、CI-H292作為杯狀細胞特性研究的體外模型。待細胞長至對數(shù)生長期時，通過細胞計數(shù)使細胞密度達3×105個細胞/ml后接種入培養(yǎng)板，分為A高劑量冰片組;B中劑量冰片組;C低劑量冰片組;D溶劑組;E生理鹽水組;F空白組，加入相應(yīng)藥物(其中冰片高、中、低濃度分別為0.2、0.1、0.05mg/ml)，應(yīng)用CCK8法檢測給藥后各組細胞在24、48、72小時的增殖活性。分別于加藥后1、5、10、15 min，ELISA法檢測各組細胞的黏蛋白的表

4、達情況。各組分別在加入相應(yīng)藥物1、5、10、15 min后，收集各組細胞，經(jīng)TRI REAGENT抽提細胞總RNA，按照RevertAidTM按轉(zhuǎn)錄試劑盒產(chǎn)品說明操作步驟，合成各組細胞cDNA第1鏈后，進行目的片段的擴增。參照文獻合成MUC5AC上下游引物。MUC5AC5'端引物:TCCGGCCTCATCTTCTCC，3'端引物:ACTTGGGCACTGGTGCTG。94℃變性30s，60℃退火50s，72℃延伸50s，循環(huán)35次。GA

5、PDH為內(nèi)參照。利用圖像分析軟件測量各組MUC5AC條帶，得出各組不同時間點表達的黏蛋白的量。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬﹦游飳嶒炑芯拷Y(jié)果:
　　除G組在靜脈注射給藥后1min內(nèi)達峰，同組不同時間點間有顯著差異(p＜0.05)外，ABC三組均在給藥后3-5min左右腦脊液中川芎嗪的濃度達峰(p＜0.05)，A、B、C復(fù)合冰片組與D、E組之間，腦脊液中川芎嗪的含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，D、E組間川芎嗪含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。G組靜

6、脈給藥（E組試劑）后1min，腦脊液中川芎嗪的濃度達峰(峰值為9.6μg/ml)。ABCDE組與G組之間比較，G組在給藥1min后濃度開始快速下降，而除F組外，其他組腦脊液中川芎嗪濃度在給藥3-5min后下降趨勢明顯。
　　結(jié)論:
　　本研究未發(fā)現(xiàn)高、中、低劑量復(fù)合冰片組經(jīng)鼻腔給藥對川芎嗪吸收入腦有明顯促進作用。經(jīng)鼻腔給藥的吸收峰時間在3-5min。冰片溶劑的配制對實驗結(jié)果無明顯影響。靜脈給藥吸收迅速，1min內(nèi)達峰，但1m

7、in后腦脊液中藥物濃度代謝速度加快。川芎嗪可能直接透過血腦屏障進入腦脊液。
　?。ǘ┘毎麑嶒炑芯拷Y(jié)果:
　　1 CCK8法檢測冰片對細胞增殖情況的研究
　　結(jié)果:
　　給藥后24h、72h，與空白組比較，各組之間對細胞增殖影響無統(tǒng)計學(xué)意義。給藥后48h，與空白組比較，高、中、低劑量冰片組促進細胞增殖(p＜0.05);溶劑組、生理鹽水組對細胞增殖差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與溶劑組比較，高、中劑量冰片組顯著促進細胞增殖(p

8、＜0.05);低劑量冰片組促進細胞增殖(p=0.038＜0.05);生理鹽水組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。高、中、低劑量冰片組間比較，中劑量冰片促進細胞增殖作用＞高劑量冰片組＞低劑量冰片組。
　　結(jié)論:
　　杯狀細胞主要分泌黏蛋白，有助于異物（藥物）的清除，實驗冰片可能促進杯狀細胞增殖，對細胞無明顯毒副作用。給藥后48h，高中劑量冰片組明顯促進細胞增殖;低劑量冰片組促進細胞增殖。本實驗中設(shè)計的冰片的濃度可能存在不足。
　　2酶

9、聯(lián)免疫法(ELISA)檢測黏蛋白(MUC5AC)表達研究
　　結(jié)果:
　　實驗各組與空白組比較，時間與組別交互效應(yīng)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。組間相同時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義。組內(nèi)比較，高、中、低劑量冰片組組內(nèi)各個時間點差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);空白組、溶劑組、生理鹽水組組內(nèi)各時間點間差異無統(tǒng)計學(xué)意義;高劑量冰片組在10-15min顯現(xiàn)抑制蛋白MUC5AC作用(p＜0.05);低劑量冰片組在15min抑制蛋白MUC5AC作用明顯

10、(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　本研究未發(fā)現(xiàn)不同濃度冰片對MUC5AC的表達有影響。高劑量冰片組在10-15min顯現(xiàn)抑制蛋白MUC5AC作用，中、低劑量冰片組在15min顯現(xiàn)抑制蛋白MUC5AC作用?？赡芤驗榉纸M使用藥物劑量不夠或因?qū)嶒炘O(shè)計中檢測時間相不夠長，黏蛋白表達量較少，導(dǎo)致組間區(qū)分度不明顯。初步揭示冰片經(jīng)鼻腔給藥促進其他藥物吸收入腦的機制可能為抑制黏蛋白分泌，增加了鼻黏膜黏液毯的清除時間，從而有效的延長藥物作用

11、時間，對此值得進一步深入研究。
　　3熒光定量PCR法檢測黏蛋白(MUC5AC) mRNA研究
　　結(jié)果:
　　給藥后1分鐘，與空白組比較，高、中、低劑量冰片組及溶劑組下調(diào)黏蛋白表達(p＜0.05)，生理鹽水組與空白組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與溶劑組比較，中劑量冰片組兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義;高劑量冰片組與低劑量冰片組下調(diào)黏蛋白表達(p＜0.05)。給藥后5分鐘，與空白組比較，高、中、低劑量冰片組下調(diào)黏蛋白表達有統(tǒng)計學(xué)意義(

12、p＜0.05);溶劑組與生理鹽水組下調(diào)黏蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與溶劑組比較，高、中、低劑量冰片組下調(diào)黏蛋白表達有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。給藥后10分鐘，與空白組比較，高、中、低劑量冰片組下調(diào)黏蛋白表達有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);溶劑組與生理鹽水組下調(diào)黏蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與溶劑組比較，高、低劑量冰片組下調(diào)黏蛋白表達有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);中劑量冰片組下調(diào)作用無統(tǒng)計學(xué)意義;高劑量冰片組與低劑量冰片組比較，高劑量冰片組

13、下調(diào)黏蛋白表達有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);中劑量冰片組與低劑量冰片組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。給藥后15分鐘，與空白組比較，高、中、低劑量冰片組下調(diào)黏蛋白表達有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);溶劑組與生理鹽水組三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與溶劑組比較，高、中劑量冰片組下調(diào)黏蛋白表達有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。高劑量冰片組與中劑量冰片組兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。組內(nèi)不同時間點比較，高、低劑量冰片組在1min時下調(diào)黏蛋白表達有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.0

14、5)，中劑量冰片組在5min時差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　冰片對MUC5AC的基因表達有下調(diào)作用。給藥一分鐘，不同濃度冰片及DMSO對MUC5AC的基因表達有不同程度的下調(diào)作用，低劑量冰片在5分鐘時下調(diào)MUC5AC的基因表達作用減弱，中劑量冰片組在5分鐘時下調(diào)MUC5AC的基因表達作用相對明顯。至15min時，低劑量冰片下調(diào)MUC5AC的基因表達作用減弱。冰片能下調(diào)MUC5ACmRNA表達，冰片經(jīng)鼻引