土槿乙酸改善ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的實驗研究：循環(huán)及斑塊內(nèi)單核吞噬細胞的變化及其潛在機制.pdf

1、目的和意義：動脈粥樣硬化（atherosclerosis, As）是心腦血管疾病的基礎(chǔ)病變，由粥樣斑塊導致血管重塑所引起相應部位的缺血和出血事件，是全世界致殘、致死的重要病因。慢性炎癥和脂質(zhì)浸潤學說是廣大學者公認的AS的發(fā)病機制，單核/巨噬細胞系作為機體固有免疫系統(tǒng)的重要防線，參與了機體慢性炎癥和斑塊內(nèi)脂質(zhì)代謝的過程，其動態(tài)變化在AS發(fā)生發(fā)展過程中起至關(guān)重要的作用。土槿乙酸（pseudolaric acid-B, PB）是一種藥理作用很

2、豐富的中藥提取物，目前已發(fā)現(xiàn)有抗腫瘤、抗生育、抗血管生成和抗真菌的作用。本人所在研究團隊的前期工作顯示PB可以激活單核細胞表面過氧化物酶增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor, PPAR），且有研究表明PPAR能夠參與炎癥反應和脂質(zhì)代謝的過程。因此，我們提出以下假說，PB通過調(diào)節(jié)單核/巨噬細胞系的變化參與慢性炎癥和斑塊內(nèi)脂質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)AS的發(fā)生發(fā)展過程。
　　研究方法，

3、第一部分：以8周齡雄性ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠作為研究對象，高脂飲食喂養(yǎng)8周形成AS后，隨機分為基線組(n=7)、高脂飲食組(n=7)、PB+高脂飲食組(n=7)、正常飲食組(n=7)和PB+正常飲食組(n=7)?；€組直接取材，其它各組干預4周后取材。進行如下檢測：（1）流式細胞術(shù)檢測各組外周血單核細胞亞群（Ly6Chi:Ly6G-CD11b+Ly6Chi, Ly6Clo:Ly6G-CD11b+Ly6Clo）比例的變化；

4、（2）免疫熒光染色檢測主動脈根部增殖巨噬細胞；（3）油紅O染色檢測主動脈、頸總動脈和主動脈根部AS斑塊負荷的面積；（4）酶聯(lián)免疫分析（Enzyme linked immune sorbent assay, ELISA）法檢測血漿中甘油三酯和總膽固醇的水平。第二部分：以RAW264.7（小鼠巨噬細胞系）為研究對象，含有熒光素標記的氧化型低密度脂蛋白（fluorescence Dil-labeled oxidized low density

5、 lipoprotein, Dil-ox-LDL）的培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細胞，分為模型組、PB組和PB+GW966.2（PPARγ阻斷劑）組，每組3個樣本，流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)Dil-ox-LDL的熒光強度。含有氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein, ox-LDL）培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細胞24小時后形成泡沫細胞，分為模型組、PB組和PB+GW966.2（PPARγ阻斷劑）組，每

6、組3個樣本，進行如下檢測:（1）油紅O染色檢測泡沫細胞形成；（2）Real-time PCR檢測PB對PPARγ、肝X受體（liver X receptors, LXR）、ATP-結(jié)合盒（ATP-binding cassette transporter1, ABC1）和CD36基因表達量的影響。
　　研究成果：動物研究發(fā)現(xiàn)（1）PB+高脂飲食組有降低Ly6Chi單核細胞亞群的趨勢，正常飲食組和PB+正常飲食組降低Ly6Chi單核細

7、胞亞群的比例；（2）PB+高脂飲食組有降低斑塊內(nèi)增殖巨噬細胞的密度的趨勢，正常飲食組和PB+正常飲食組降低斑塊內(nèi)增殖巨噬細胞的密度；（3）PB+高脂飲食組有降低血漿總膽固醇和甘油三酯水平的趨勢，正常飲食組和PB+正常飲食組降低血漿總膽固醇、甘油三酯的水平；（4）PB+高脂飲食組和正常飲食組均有降低主動脈根部、頸總動脈和主動脈的斑塊負荷的趨勢，PB+正常飲食組降低主動脈根部、頸總動脈和主動脈的斑塊負荷。細胞研究發(fā)現(xiàn)（1）PB降低巨噬細胞內(nèi)

8、Dil-ox-LDL的熒光強度；（2）PB能降低泡沫細胞內(nèi)PPARγ、LXRα和ABC1的表達量。
　　結(jié)論及意義：1.高脂飲食可以升高 ApoE-/-小鼠體內(nèi)甘油三酯和總膽固醇水平，使Ly6Chi單核細胞亞型的比例、斑塊內(nèi)增殖巨噬細胞的密度升高，促進 AS的形成。PB+高脂飲食組有降低脂質(zhì)、Ly6Chi比例、增殖巨噬細胞密度和斑塊負荷的趨勢。正常飲食組降低脂質(zhì)、Ly6Chi比例和增殖巨噬細胞密度，有降低斑塊負荷的趨勢。PB+正常