山茱萸種質(zhì)資源多樣性評(píng)價(jià).pdf

1、山茱萸（CornusofficinalisSieb.et Zucc.）為山茱萸科（Cornaceae）山茱萸屬（Cornus)植物，別名山萸肉、萸肉、棗皮等，為名貴中藥材，在我國(guó)的栽培歷史悠久，《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草經(jīng)集注》、《吳普本草》、《范子計(jì)然》、《千金翼方》、《圖經(jīng)本草》等典籍中均有記載。其性味酸、澀，微溫，入肝腎兩經(jīng)，具有補(bǔ)益肝腎，澀精固脫的功效。近年來(lái)還引用到園林綠化之中，因其花、果、葉、樹姿具有獨(dú)特的觀賞特性而倍受人們的喜

2、愛。山茱萸主要分布于我國(guó)的河南、浙江、陜西等省，四川、安徽、山東亦有分布。長(zhǎng)期以來(lái)山茱萸大多處于半野生狀態(tài)，而且由于異花授粉和生長(zhǎng)環(huán)境條件的差異，導(dǎo)致種內(nèi)變異大，品種良莠不齊，產(chǎn)量高低不一，品質(zhì)差異較大。
　　本研究以不同產(chǎn)區(qū)的63份山茱萸葉片樣本為材料，通過(guò)對(duì)形態(tài)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)分析，比較了不同產(chǎn)區(qū)葉片的形態(tài)差異；以西峽、內(nèi)鄉(xiāng)48份山茱萸果實(shí)為材料，通過(guò)硫酸苯酚法測(cè)定山茱萸多糖含量，分析了不同優(yōu)株的多糖含量，為山茱萸新品種的選育提供參

3、考。
　　本研究以不同產(chǎn)區(qū)的100個(gè)山茱萸樣本為材料，進(jìn)行直接PCR測(cè)序獲得ITS和葉綠體基因序列，利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行ITS和葉綠體基因序列分析，從分子水平比較了不同產(chǎn)區(qū)山茱萸群體間的差異，探討了群體間的親緣關(guān)系及ITS序列對(duì)不同群體的鑒別問(wèn)題，以期從DNA水平上了解不同產(chǎn)區(qū)的山茱萸親緣關(guān)系及種質(zhì)資源遺傳背景，為中國(guó)山茱萸資源的分類、保護(hù)和利用提供理論依據(jù)。
　　主要研究結(jié)果如下：
　?。?）本研究對(duì)63份山茱萸葉

4、片的統(tǒng)計(jì)分析表明：山茱萸葉片變異系數(shù)較大，多樣性豐富；不同主產(chǎn)區(qū)之間有較為明顯的差異，河南（伏牛山區(qū)）的山茱萸葉片較小，平均葉長(zhǎng)7.91cm，小于西北地區(qū)的8.48和中南地區(qū)的8.86，西北地區(qū)的葉片變幅較小，變異系數(shù)小，為11.05。葉片寬河南地區(qū)的平均值為4.35cm，也小于西北地區(qū)（4.60cm）和中南地區(qū)（4.72cm），葉片看的變幅也是西北地區(qū)的樣本最小。
　?。?）本研究通過(guò)硫酸苯酚法對(duì)48份山茱萸果實(shí)多糖含量的測(cè)定分

5、析表明：不同山茱萸優(yōu)株之間，多糖含量變異系數(shù)較大，差異顯著。
　　（3）本研究通過(guò)對(duì)山茱萸ITS、trnC-F、trnQ-rps16和trnL-trnF序列的克隆，擴(kuò)增，純化、測(cè)序，改良了針對(duì)山茱萸的DNA提取方法，確立了最優(yōu)的P CR的擴(kuò)增體系及程序。
　　（4）山茱萸ITS序列長(zhǎng)度變化范圍為658-668bp（不考慮Gap)，其中ITS1序列長(zhǎng)度為238-247bp，ITS2序列長(zhǎng)度為263-267bp。5.8S rDN

6、A的長(zhǎng)度非常保守，經(jīng)比對(duì),參試樣本的5.8S rDNA長(zhǎng)度為153-155bp，起始于第263個(gè)堿基,終止于第424個(gè)堿基。
　　不同山茱萸樣本ITS1和ITS2堿基含量呈現(xiàn)差別，其中ITS1序列中GC含量為62.6％～72.5%，ITS2中GC含量為58%～67%，5.8S rDNA編碼區(qū)堿基組成GC含量為51.9%～56.1%各區(qū)域G+C含量都較高，而且ITSl和ITs2區(qū)域的G+C含量明顯比5.8S的高。
　　所有10

7、0條ITS的675bp中共檢測(cè)到150個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)，占總位點(diǎn)的22.2%；簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)80個(gè)，占總位點(diǎn)的11.85%。其中ITS1區(qū)域檢測(cè)到87處變異位點(diǎn)，占ITS1序列的34.8%；簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)64個(gè)，占總位點(diǎn)的25.6%，而ITS2區(qū)域共檢測(cè)到56處變異位點(diǎn)，占其總長(zhǎng)度的20.81%，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)18個(gè)，占總位點(diǎn)6.7%,而5.8S r DNA編碼區(qū)較為保守，僅有8個(gè)變異位點(diǎn)，占其總長(zhǎng)的5.1%，無(wú)簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn)。
　　（

8、5）對(duì)所有13省市地區(qū)群體的ITS序列單倍型多樣性（h）及核苷酸多樣性（π）的檢測(cè)結(jié)果表明：山茱萸種質(zhì)表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性水平（h=0.735，π=0.01027），且不同群體間的核苷酸多態(tài)性水平表現(xiàn)出較大的差異（h=0.000~1.000，π=0.000~0.02238），綜合來(lái)看山茱萸各個(gè)群體中遺傳多樣性水平最高的應(yīng)當(dāng)是浙江（ZJ）群體（h=0.853，π=0.02238）。
　?。?）本試驗(yàn)通過(guò)群體內(nèi)遺傳距離及群體間遺傳距

9、離的研究表明：候選ITS片段的群體間平均距離大于群體內(nèi)距離，且群體內(nèi)和群體間存在的重疊程度較小，因此，ITS具有作為山茱萸不同產(chǎn)區(qū)群體間植物條形碼的潛力。
　　（7）本試驗(yàn)以ITS序列為基礎(chǔ)，通過(guò)最大簡(jiǎn)約法（Maximum parsimony，MP）和鄰接法（NJ）構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明：不同產(chǎn)區(qū)山茱萸引種頻繁，不同群體間的親緣關(guān)系差異顯著，綜合鑒定率僅1.4%。
　?。?）本試驗(yàn)研究表明：山茱萸種群間遺傳距離的變化范圍

10、在0.000~0.052之間，平均為0.018。其中浙江種群（ZJ）和重慶（CQ-FJ）種群之間，浙江種群（ZJ）和湖南種群（HN-GY）的遺傳距離最遠(yuǎn)，分化程度最高；而湖南（HN-GY）種群和重慶（CQ-FJ）種群的遺傳距離最小，分化程度相對(duì)較低；
　?。?）在本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示山茱萸葉綠體trnQ-rps16基因片段長(zhǎng)為1512bp，G+C含量為51.8%；葉綠體trnC-F基因長(zhǎng)為874bp,G+C含量為48%；葉綠體trn