核酶和RNA干擾靶向治療慢性粒細(xì)胞性白血病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文核酶和RNA干擾靶向治療慢性粒細(xì)胞性白血病的實(shí)驗(yàn)研究姓名：陳波斌申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：內(nèi)科學(xué)指導(dǎo)教師：林果為20030501梭酶鞠R N A 予撬避囊港療經(jīng)經(jīng)粒搦藏鞋爨瓤瘸靛實(shí)驗(yàn)磺究s i R N A ) 模扳的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)、合成2 條寡核瞥酸鏈，退火后構(gòu)建到p S i l e n c e r l ．0 - u 6上，經(jīng)限制性酶切和測(cè)序鑒定，大量抽提純化，以X ．t r e m e G E N E Q 2 轉(zhuǎn)染K

2、 5 6 2 細(xì)胞：收集轉(zhuǎn)染聰4 8 和7 2 小時(shí)的細(xì)胞，分別應(yīng)用A 1 1 n e x i n V I F I T c + P I 染色和T U N E L 。F I T C法通過(guò)滾式綴腿術(shù)撿測(cè)細(xì)您穗亡壤囂。研究結(jié)祭1 ．含有M 1 ．G S R N A 模板序列的p G S 2 1 0 和含有底物序列的p B C R ．A B L 經(jīng)限制性酶切分析和測(cè)序鑒定證實(shí)構(gòu)建成功；進(jìn)行細(xì)胞外轉(zhuǎn)淥和切害4 實(shí)驗(yàn)，通過(guò)放射自顯影檢測(cè)顯示：M I

3、 ．G SR N A 與人工底物按照l(shuí) ：5 的遺疑進(jìn)孝亍混合4 小時(shí)黥切割率為2 8 。6％，叛l ；l 豹斃弼混合4 ，l 、霹熬韜蘩率秀弱。2 ％，對(duì)照壅撬M H C 豹M t R N A 對(duì)予人工械物無(wú)切割作用；構(gòu)建的質(zhì)粒p A V G S 4 經(jīng)限制性酶切分析和測(cè)序鑒定證實(shí)構(gòu)建成功，大量抽提純化后的產(chǎn)物濃度和純度符合轉(zhuǎn)染要求。2 ．在p A V G S 4 轉(zhuǎn)染K 5 6 2 細(xì)胞屆2 4 、4 8 、7 2 和9 6 小時(shí)，

4、作R T - P C R 分析顯示：在轉(zhuǎn)染屠2 4 小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組鰓臌嚏B C R - A B Lm R N A 隨時(shí)間的延長(zhǎng)含攝下降近1 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，7 2 露％奎楚越B C R - A B L m R N A 熬含鬣談送，囂懟爨綴無(wú)驥囂改交。W e s t e r nB l o t t i n g 分析顯示：實(shí)驗(yàn)綴在4 8 小時(shí)的灰發(fā)怒同期對(duì)照組的1 0 ．4 ％，9 6 小時(shí)時(shí)為6 ．7 ％。3 ．凋亡分析：轉(zhuǎn)染7 2 小時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)

5、照組的細(xì)胞作電鏡分析，在實(shí)驗(yàn)組見(jiàn)到大量凋亡細(xì)囂艇，而對(duì)照組少見(jiàn)；成用A n n e x i n V + P I 法梭測(cè)凋亡，在轉(zhuǎn)染2 4 、4 8 、7 2 和9 6棗露瓣疆亡率分蠲為4 ．5 ％。2 0 ．1 ％、4 2 ，3 ％稿5 6 ％( p 《。0 0 0 1 ) ，蠢對(duì)照縫在不弱時(shí)闖靜凋亡率5 ％～6 ％( p > O ．0 5 ) ；通過(guò)T U N E L 法檢測(cè)上述時(shí)闊的蠲亡事實(shí)驗(yàn)組分荊為：5 ．6 ％、2 4 ．

6、4 ％、4 3 ．2 ％和5 8 ．4 ％( p0 ．0 5 ) 。4 ．R N A i 對(duì)于K 5 6 2 細(xì)胞凋亡的影響：構(gòu)建含有s i R N A 模板的p B C R 6 載體經(jīng)限制性酶切分析和測(cè)序鑒定，載體內(nèi)臺(tái)有目標(biāo)序列；經(jīng)大量抽提純化后檢測(cè)p B C R 6 的濃度窩筑魔簿合轉(zhuǎn)染要求；在轉(zhuǎn)染4 8 秘7 2 小時(shí)黷攥A n n e x i n V + P I 縶魏鹼溺蠲亡率為：2 5 ，5 ％秘4 8 + G ％如 0 。0

7、 5 ) ；藏麗T U N E L 法檢測(cè)2 個(gè)時(shí)間的凋亡率為2 9 ．8 ％和5 3 ％0O ．0 5 ) 。研究結(jié)論1 ．本蜜驗(yàn)已盛功鐫建含露M 1 ．G SR N A 模掇寢剜的真核表達(dá)載體p A V G S 4 ，進(jìn)孳亍桶藏步} 切簦實(shí)驗(yàn)顯示熬霄特異往甥裁藏狻戇效瘟；2 ．將p A V G S 4 轉(zhuǎn)染K 5 6 2 細(xì)胞株后發(fā)現(xiàn)M 1 ．O SR N A 具有特異性切割B C R ·A B Lm R N A 作用，而