丹參道地藥材cDNA芯片構(gòu)建及毛狀根基因表達(dá)譜研究.pdf

1、丹參SalviamilitiorrhizaBge.為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，具有活血化瘀，通經(jīng)止痛的功效。丹參中主要含有脂溶性二萜醌類化合物和水溶性化合物，其中以丹參酮IIA為代表的二萜醌類化合物是治療心腦血管系統(tǒng)疾病的重要藥物。丹參種質(zhì)層次不齊，不同產(chǎn)地質(zhì)量差異懸殊，急需利用現(xiàn)代生物技術(shù)和分子生物學(xué)研究手段尋找次生代謝關(guān)鍵酶基因，明確影響其含量的關(guān)鍵因素，為培育優(yōu)良種質(zhì)、提高組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因丹參中目的產(chǎn)物含量提供基礎(chǔ)。道地藥材是中藥材質(zhì)量

2、控制的一項(xiàng)獨(dú)具特色的綜合判斷標(biāo)準(zhǔn)，為從基因水平闡釋道地藥材的形成機(jī)理，大規(guī)模尋找功能基因，本論文制作了首張道地藥材基因芯片，并對(duì)不同時(shí)期毛狀根進(jìn)行基因表達(dá)譜研究，得到一批與次生代謝有關(guān)的基因，為丹參功能基因組學(xué)和道地藥材形成機(jī)理研究探索了新的思路和方法。 主要研究結(jié)果如下：1.構(gòu)建了道地產(chǎn)區(qū)丹參根的cDNA噬菌體文庫(kù)，庫(kù)容為3×105，插入片段500～2500bp。 2.制作了包含4354個(gè)克隆的丹參cDNA芯片，它是首

3、張有關(guān)道地藥材的芯片。 3.得到114個(gè)在毛狀根不同時(shí)期差異表達(dá)的獨(dú)立基因(Unigene)。52個(gè)為丹參中首次報(bào)道。 4.利用NCBI的BLASTX和BLASTN工具對(duì)差異基因進(jìn)行功能注釋，有92.10﹪的基因得到注釋。 5.67個(gè)基因得到“GO”注釋，分別歸入細(xì)胞組成、分子功能和生物過(guò)程三個(gè)分支。 6.26個(gè)基因涉及29個(gè)代謝相關(guān)的酶在KEGG“PATHWAY”中得到注釋，參與碳水化合物代謝、次生代謝

4、和氨基酸代謝的最多。 7.通過(guò)Northern點(diǎn)雜交檢驗(yàn)5個(gè)基因在60天和30天材料中的表達(dá)情況，結(jié)果與芯片雜交結(jié)果完全一致。 8.首次得到1個(gè)丹參二萜生物合成基因的cDNA片段，copalyldiphosphatesynthase(CPS)。序列長(zhǎng)度為1479bp，編碼418個(gè)氨基酸，為C末端。具有Terpene_cyclase_plant_C1保守區(qū)，為丹參酮類合成中的關(guān)鍵酶基因。 9.得到8個(gè)P450基因c

5、DNA片段，4個(gè)為首次報(bào)道。 10.首次從丹參中克隆8個(gè)基因全長(zhǎng)序列。分別為2個(gè)Aldo-ketoreductase家族基因，2個(gè)金屬硫蛋白基因，雙烯內(nèi)酯水解酶基因，翻譯控制腫瘤蛋白基因，類萌芽素蛋白基因及乙烯應(yīng)答因子結(jié)合蛋白基因。 總之，本論文構(gòu)建了以傳統(tǒng)藥用植物和道地藥材為研究主題的首張芯片，得到114個(gè)差異基因，52個(gè)為首次報(bào)道。利用BLAST、GO以及PATHWAY進(jìn)行生物信息學(xué)分析，首次得到1個(gè)二萜生物合成基因