人心房肌電和結(jié)構(gòu)重構(gòu)與房顫的關(guān)系及Ang Ⅱ的作用.pdf

1、心房顫動(dòng)(atrialfibrillationAF)是臨床上最常見的復(fù)雜心律失常之一，其發(fā)病率隨年齡增長而顯著增加，并成為一種獨(dú)立的危險(xiǎn)因素使患者殘率、致死率增加，因而是當(dāng)前心血管疾病的一個(gè)研究重點(diǎn)，也是心律失常領(lǐng)域中亟待解決的難題。目前房顫的治療包括藥物療法和近十幾年來開展的介入療法和新的手術(shù)方法，但其效果有限，絕大多數(shù)患者的癥狀和預(yù)后得不到明顯的改觀。為此，加深對(duì)房顫機(jī)制的認(rèn)識(shí)，針對(duì)病理基礎(chǔ)尋求治療手段是當(dāng)前房顫研究的重點(diǎn)，其中對(duì)心

2、房重構(gòu)(包括心房電重構(gòu)與心房解剖重構(gòu))的深入研究可能會(huì)使我們發(fā)現(xiàn)房顫的更深層次的機(jī)制，從而找到解決房顫的有效方法。 近年來人們觀察到房顫具有自身延續(xù)性，慢性持續(xù)性房顫常由多次的陣發(fā)性房顫做為先導(dǎo)，房顫終止以后再次復(fù)發(fā)的可能性與房顫持續(xù)的時(shí)間密切相關(guān)。1995年Wijffels等在山羊模型上發(fā)現(xiàn)，隨著快速心房刺激時(shí)間的延長，有效不應(yīng)期(AERP)進(jìn)行性縮短，房顫的誘發(fā)率明顯增高，持續(xù)時(shí)間逐漸延長；即房顫本身可誘發(fā)心房的電生理改變，

3、使房顫容易發(fā)生和持續(xù)，人們將這種現(xiàn)象稱為心房電重構(gòu)(AtrialelectricalremodelingAER)，主要表現(xiàn)為有效不應(yīng)期縮短和有效不應(yīng)期頻率適應(yīng)不良。它在房顫的發(fā)生、持續(xù)及房顫引起的一系列心房功能改變中起著重要作用。作為持續(xù)性房顫產(chǎn)生機(jī)制的最新進(jìn)展，心房電重構(gòu)為房顫的防治提供了新的方向，成為目前的研究熱點(diǎn)。 在對(duì)心房電重構(gòu)不斷深入的研究中，人們還發(fā)現(xiàn)，房顫轉(zhuǎn)復(fù)為竇性心律后，心房的電生理特性很快恢復(fù)到正常狀態(tài)，而心房

4、收縮功能卻需幾周甚至數(shù)月才能恢復(fù)正常。在快速起搏右心室產(chǎn)生心力衰竭后誘發(fā)房顫的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，心房有效不應(yīng)期、房顫波長及其離散度沒有發(fā)生明顯改變，這說明除了心房電重構(gòu)之外，還有其它因素參與了房顫的發(fā)生與維持。近來研究表明，心房肌細(xì)胞在房顫期間發(fā)生了非常明顯的結(jié)構(gòu)變化，即發(fā)生了結(jié)構(gòu)重構(gòu)(atrialanatomicalremodelingAAR)。 多年來人們對(duì)心房電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)進(jìn)行了大量的研究和探索，取得了一些成績，但有關(guān)房顫

5、發(fā)生和維持的確切機(jī)制仍然不是很明確，臨床治療中藥物的有效性和副作用等方面的很多問題仍沒有得到很好的解決。因此有必要在房顫發(fā)生的電生理機(jī)制和藥物干預(yù)方面做進(jìn)一步的深入研究，為最終解決房顫問題提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究目的:通過實(shí)驗(yàn)探討心房顫動(dòng)時(shí)血管緊張素Ⅱ參與心房電重構(gòu)和解剖重構(gòu)的可能機(jī)制，并觀察其受體拮抗劑對(duì)心房重構(gòu)的影響，為臨床應(yīng)用血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑治療心房顫動(dòng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 1.采用膠原酶兩步消化法急性分離單個(gè)人的心房

6、肌細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行鑒定；采用組織塊法進(jìn)行人的心房肌細(xì)胞體外培養(yǎng)的嘗試，通過上述兩種方法得到單個(gè)人的心房肌細(xì)胞，為直接應(yīng)用人的心房肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)建立細(xì)胞模型。 2.觀察血管緊張素Ⅱ?qū)φＨ说男姆考〖?xì)胞L型鈣電流(ICa-L)；瞬時(shí)外向鉀電流(Ito)和內(nèi)向整流鉀電流(IK1)的影響，并與心房顫動(dòng)患者心房肌細(xì)胞上述電流的改變進(jìn)行比較，了解血管緊張素Ⅱ參與心房顫動(dòng)時(shí)心房電重構(gòu)的機(jī)制；并給與血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑替米沙坦進(jìn)行干預(yù)，了解其拮

7、抗作用。 3.觀察心房顫動(dòng)和不伴心房顫動(dòng)患者心房肌細(xì)胞鈣超載的情況，并在正常心房肌細(xì)胞上用血管緊張素Ⅱ進(jìn)行驗(yàn)證，觀察其對(duì)鈣超載的影響，同時(shí)給予血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑替米沙坦進(jìn)行干預(yù)，了解其對(duì)心房肌細(xì)胞鈣超載的作用。 4.對(duì)伴心房顫動(dòng)和不伴有心房顫動(dòng)的患者心房肌細(xì)胞進(jìn)行光鏡下組織結(jié)構(gòu)、電鏡下超微結(jié)構(gòu)和心肌細(xì)胞間縫隙連結(jié)蛋白的對(duì)比研究，了解心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)與房顫的關(guān)系及可能的機(jī)制。 方法與技術(shù)路線:1、人單個(gè)心房肌細(xì)胞的

8、急性分離及活性鑒定：心臟外科接受體外循環(huán)手術(shù)的患者建立體外循環(huán)前切取右心耳組織，常規(guī)處理后，采用膠原酶和蛋白酶兩步消化法，再加磁力攪拌及充氧分離出單個(gè)人的心房肌細(xì)胞。進(jìn)行濃度梯度法復(fù)鈣后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并攝片；全細(xì)胞膜片鉗法記錄細(xì)胞膜鉀電流；臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定活細(xì)胞。 人心房肌細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定：采用組織塊貼壁法培養(yǎng)心房肌細(xì)胞，用胰酶消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并攝片；制備細(xì)胞片固定后加鼠抗人平滑肌α-Ac

9、tin和SPA-HRP標(biāo)記的二抗作免疫細(xì)胞化學(xué)染色；加羊抗人TnI、鼠抗人平滑肌α-Actin、加兔抗羊IgG-FITC和羊抗鼠IgG-CY3作免疫熒光染色；制備電鏡標(biāo)本進(jìn)行透射電鏡觀察。 2、電生理學(xué)測(cè)定：采用全細(xì)胞膜片鉗模式記錄細(xì)胞膜各種電流：取保存在KB液中的人的心房肌細(xì)胞懸液，置于倒置顯微鏡實(shí)驗(yàn)平臺(tái)上的灌流槽內(nèi)，靜置使細(xì)胞貼附于底壁，而后根據(jù)所要記錄的電流來選擇不同的細(xì)胞外液進(jìn)行灌流。拉制膜片鉗微電極；選擇合適的細(xì)胞后進(jìn)

10、行電極尖端與細(xì)胞膜之間的巨阻抗封接；破膜后進(jìn)行電容補(bǔ)償，建立全細(xì)胞記錄模式。 取急性分離的正常人的心房肌細(xì)胞，復(fù)鈣后采用全細(xì)胞膜片鉗法記錄細(xì)胞膜L型鈣電流(ICa-L)；瞬時(shí)外向鉀電流(Ito)和內(nèi)向整流鉀電流(IK1)。再分別加入血管緊張素Ⅱ和替米沙坦進(jìn)行干預(yù)，觀察各電流的變化。 取急性分離的心房顫動(dòng)和不伴心房顫動(dòng)患者的心房肌細(xì)胞(部分房顫患者預(yù)先給予替米沙坦制劑干預(yù))，再記錄上述細(xì)胞膜各種電流的變化。 3、應(yīng)

11、用激光掃描共聚焦顯微鏡測(cè)定人心房肌細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度：首先用Fluo-3/AM負(fù)載單個(gè)人心房肌細(xì)胞，然后在激光掃描共聚焦顯微鏡下掃描細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度，應(yīng)用數(shù)字傳入式攝像機(jī)和高速度計(jì)算機(jī)處理軟件得到清晰的細(xì)胞內(nèi)鈣分布圖像，利用其圖像量化、分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，并換算出某一選定區(qū)域內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的曲線 首先對(duì)正常人的心房肌細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，細(xì)胞外液中加入血管緊張素Ⅱ及其受體拮抗劑替米沙坦進(jìn)行干預(yù)后，分別測(cè)定各組細(xì)胞的鈣離子

12、濃度。然后用同樣的方法再測(cè)定房顫和非房顫患者心房肌細(xì)胞的鈣離子濃度。 4、收集心臟外科行心臟手術(shù)的慢性房顫和不伴慢性房顫患者的右心耳標(biāo)本，固定后分別制備組織切片標(biāo)本進(jìn)行光鏡下纖維結(jié)締組織的定量評(píng)定；制備電鏡標(biāo)本進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)改變的評(píng)估；制備免疫組化標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞縫隙連結(jié)蛋白CX40的半定量分析。 結(jié)果:1、單個(gè)人心房肌細(xì)胞的急性分離及培養(yǎng)的結(jié)果：采用改良的膠原酶兩步消化法及磁力攪拌后分離出的細(xì)胞具有人心房肌細(xì)胞的典型特征。細(xì)

13、胞呈桿狀、橫紋清晰、細(xì)胞膜完整，部分細(xì)胞還有收縮現(xiàn)象發(fā)生。膜片鉗記錄到的鉀電流符合正常人心房肌細(xì)胞鉀電流的特征。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞成活率50-70％，細(xì)胞存活時(shí)間超過24小時(shí)。 采用組織塊貼壁法培養(yǎng)的人心房肌細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡觀察，貼塊4-5d后即可見有細(xì)胞從肌小粒邊緣爬出，細(xì)胞呈梭形，10d左右細(xì)胞生長密度可達(dá)瓶底的70％～80％，每4-5d可傳代一次，大多可傳8代，細(xì)胞生長共1.5月余。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，培養(yǎng)的細(xì)胞90％以上

14、非特異性α-Actin抗體染色陽性，平滑肌特異性α-Actin抗體染色陰性；心肌特異性TnI抗體染色陽性，證明培養(yǎng)的細(xì)胞為心肌細(xì)胞。透射電鏡觀察，培養(yǎng)3代的細(xì)胞可見較多微(肌)絲和線粒體，細(xì)胞器靠近細(xì)胞核，符合典型心房肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的特征。 2、全細(xì)胞膜片鉗法記錄細(xì)胞膜電流的變化：血管緊張素Ⅱ使人心房肌細(xì)胞Ito峰值電流密度明顯下降。替米沙坦對(duì)Ito無顯著影響，但可拮抗血管緊張素Ⅱ的作用，使Ito峰值電流密度下降程度減輕。

15、 血管緊張素Ⅱ使人心房肌細(xì)胞ICa-L和IK1峰值電流密度明顯增加，替米沙坦可使ICa-L和I¨峰值電流密度增加程度減輕，對(duì)血管緊張素Ⅱ產(chǎn)生拮抗作用。 房顫組心房肌細(xì)胞所記錄的Ito峰值電流密度與非房顫組心房肌細(xì)胞相比明顯下降；IK1峰值電流密度明顯增加；房顫組ICa-L峰值電流密度低于非房顫組。 加替米沙坦干預(yù)后IK1的電流密度明顯降低；Ito的電流密度明顯回升；ICa-L的電流密度值略高于房顫組。 3、激

16、光掃描共聚焦顯微鏡測(cè)定結(jié)果：血管緊張素Ⅱ加入后即刻，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度開始增加，15min后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度和光密度值顯著增高，而加入替米沙坦15min后細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度和熒光光密度值低于血管緊張素Ⅱ。房顫患者心房肌細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i顯著升高，替米沙坦干預(yù)后患者心房肌細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度和熒光光密度值降低。 4、光鏡下可見慢性房顫心房組織中細(xì)胞數(shù)目減少，結(jié)締組織增生明顯，并可見肌細(xì)胞溶解。超微結(jié)構(gòu)水平，可見房顫細(xì)胞收縮元素減少，肌纖維溶

17、解區(qū)線粒體增生。細(xì)胞縫隙聯(lián)接蛋白CX40在房顫細(xì)胞明顯減少且排列紊亂。 結(jié)論:1、成功建立的急性分離及培養(yǎng)方法所得到的人心房肌細(xì)胞具有心肌細(xì)胞的典型形態(tài)特征、細(xì)胞生物學(xué)和電生理學(xué)特性。為進(jìn)一步開展人心房肌細(xì)胞分子生物學(xué)、人心房肌細(xì)胞移植、人心房肌細(xì)胞基因表達(dá)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 2、血管緊張素Ⅱ?qū)θ诵姆考〖?xì)胞具有明顯的電生理作用，能使心房肌細(xì)胞膜L型鈣電流(ICa-L)、瞬時(shí)外向鉀電流(Ito)和內(nèi)向整流鉀電

18、流(IK1)發(fā)生變化，血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑替米沙坦可以使其作用減輕，血管緊張素Ⅱ通過影響人心房肌細(xì)胞膜主要離子流參了與AF的發(fā)生和發(fā)展。 3、人心房肌細(xì)胞在血管緊張素Ⅱ的刺激下細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯升高，血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑替米沙坦能拮抗這一作用，而且還能減低房顫患者心房肌細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，提示心房肌胞內(nèi)鈣超載也參與AF的形成。 4、心房顫動(dòng)時(shí)心房肌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞、組織結(jié)構(gòu)變化及細(xì)胞縫隙聯(lián)接蛋白的改變，證明其對(duì)房顫的發(fā)