同種異體骨移植中骨形成相關(guān)因子表達(dá)趨勢(shì)研究.pdf

1、同種骨材料具有豐富的來源，且因其具有天然結(jié)構(gòu)、形狀和強(qiáng)度，有一定的誘導(dǎo)活性，在骨移植中有其不可替代的地位。冷凍、凍干和脫鈣同種骨均已應(yīng)用于臨床，包括骨腔充填、骨段移植術(shù)、關(guān)節(jié)融合術(shù)和假體重建術(shù)等諸多方面。例如脫鈣骨，經(jīng)化學(xué)滅菌、提取抗原和自溶消化處理后，其可溶性同種抗原得到消除，植入受體后，新骨形成遠(yuǎn)較運(yùn)用新鮮骨、凍干全骨或Co 60輻照滅菌的凍干骨時(shí)為多。 在骨移植后的骨折愈合過程中，包括了骨祖細(xì)胞的趨化、增殖、分化以及合成細(xì)

2、胞外基質(zhì)的多個(gè)組織學(xué)進(jìn)程。自細(xì)胞、血管以及骨基質(zhì)的損傷開始，最終至徹底重新塑形且無瘢痕形成，新骨形成是相關(guān)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的連續(xù)變化過程。通過多年的研究，目前，骨折愈合的組織學(xué)過程和特征已得到明確闡述，但分子水平的調(diào)控機(jī)制方面仍有待進(jìn)一步明確。國(guó)內(nèi)外研究者采用免疫組織化學(xué)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse Transcription-Polymerase ChainReaction，RT-PCR)、原位雜交等方法，檢測(cè)了骨形

3、成相關(guān)發(fā)生蛋白-2(BoneMorphogenetic Protein-2，BMP-2)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular EndothelialGrowm Factor，VEGF)、腫瘤生長(zhǎng)因子-β(Tumor Growth Facto-β，TGF-β)在骨折愈合過程中的內(nèi)源性表達(dá)，考核了多種因子在骨折愈合中的誘導(dǎo)成骨作用，表明上述骨形成因子是骨折愈合過程中的關(guān)鍵物質(zhì)。對(duì)于骨折區(qū)域的新生骨發(fā)育相關(guān)細(xì)胞，多種生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)其增殖、分

4、化以及細(xì)胞外基質(zhì)合成，對(duì)骨折修復(fù)的啟動(dòng)、發(fā)展、調(diào)控及改建起重要作用。鑒于此，應(yīng)用生長(zhǎng)因子促進(jìn)骨折愈合可能取得良好的療效，研究者們也開展了廣泛的基礎(chǔ)研究，在此基礎(chǔ)上的一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用結(jié)果也表明，生長(zhǎng)因子類物質(zhì)用于骨折延遲連接或骨不連的治療確有良好效果。雖然骨折愈合的分子調(diào)控中有許多生長(zhǎng)因子參與，但目前只對(duì)少數(shù)幾種的作用機(jī)制有所了解，其中研究較為透徹的是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Protein,BMP)家

5、族、TGF-β以及VEGF等。上述幾種骨形成相關(guān)因子由炎癥細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞合成，在骨折愈合全過程持續(xù)表達(dá)，因此對(duì)于骨愈合的進(jìn)程以及骨移植的效果評(píng)價(jià)具有客觀性。本研究主要對(duì)同種異體骨移植及自體骨移植后的愈合過程中BMP-2、VEGF及TGF-β的表達(dá)情況進(jìn)行定量考察及變化趨勢(shì)分析，以選擇可能存在的合適的術(shù)后時(shí)間段，保證以上三種生長(zhǎng)因子的分泌表達(dá)都處于上升期甚至達(dá)到峰值，為術(shù)后干預(yù)提供參考。在以往的研究中，人們多是對(duì)單一運(yùn)用的細(xì)胞因

6、子與骨修復(fù)的關(guān)系進(jìn)行評(píng)價(jià)和考核，結(jié)果確切，但卻未曾考慮到多種因子可能存在強(qiáng)烈的協(xié)同或拮抗作用。為了使試驗(yàn)接近機(jī)體內(nèi)部的真實(shí)進(jìn)程，我們對(duì)三種因子的表達(dá)情況、變化趨勢(shì)同時(shí)進(jìn)行考核，并且探討之間可能的相互關(guān)系，為多因子聯(lián)合應(yīng)用于骨修復(fù)的臨床方案提供可能的理論依據(jù)。此外，本研究還對(duì)同種異體骨和自體骨移植相同時(shí)間區(qū)段內(nèi)的內(nèi)源性相關(guān)生長(zhǎng)因子表達(dá)進(jìn)行比較，從分泌生長(zhǎng)因子的角度評(píng)判同種異體骨和自體骨移植的區(qū)別，為選擇更能促進(jìn)骨再生的骨移植材料來源提供佐

7、證。盡管在骨移植后，機(jī)體的骨形成機(jī)理已經(jīng)得到較完整的闡述，但本研究考察的多種因子的持續(xù)表達(dá)也是一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化和非直觀化的過程，其評(píng)價(jià)難以簡(jiǎn)單地量化。 應(yīng)用光鏡進(jìn)行觀察屬于較簡(jiǎn)單和直接的方式，但是只能起到定性的判斷，而且其判斷受操作者的主觀因素、觀察區(qū)域及實(shí)驗(yàn)儀器的客觀因素的影響較大，難以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。而免疫組織化學(xué)染色、放射骨顯影定量評(píng)價(jià)、生物力學(xué)分析以及RT-PCR等手段的應(yīng)用，可以達(dá)到較精細(xì)程度的考量，為移植骨區(qū)域骨再

8、生的量化評(píng)判提供了多種選擇： (1)免疫組織化學(xué)染色：上世紀(jì)90年放代以來，金巖和張子軍等人利用免疫組織化學(xué)方法，對(duì)骨折區(qū)域的BMP-2表達(dá)進(jìn)行了定量和定位研究，發(fā)現(xiàn)了BMP-2的分泌表達(dá)存在一定的時(shí)間依賴性，得到了其變化趨勢(shì)，同時(shí)還證實(shí)了骨缺損區(qū)存在的BMP-2濃度梯度，為BMP-2的表達(dá)研究奠定了基礎(chǔ)。近年來，還有人應(yīng)用原位雜交技術(shù)證明了BMP-2的mRNA表達(dá)規(guī)律與蛋白的表達(dá)相一致，提示BMP-2表達(dá)情況的研究將會(huì)為開發(fā)

9、內(nèi)源性BMP-2在臨床中的應(yīng)用提供廣闊的前景。 (2)放射骨顯影定量評(píng)價(jià)：骨骼的主要無機(jī)鹽成份是羥基磷灰石晶體，其結(jié)構(gòu)類似離子交換柱，具有很大表面積，通過化學(xué)吸附和離子交換從血液中獲取磷酸鹽和其它元素來完成代謝更新。骨移植后，待軟組織損傷反應(yīng)減退，局部骨顯像若見移植骨處放射性近似或高于正常骨組織，表明血運(yùn)良好，植骨成活。 (3)生物力學(xué)分析：通過抗扭強(qiáng)度等參數(shù)的分析，術(shù)后生成新骨的質(zhì)量也可以得到較好的監(jiān)控。(4)RT

10、-PCR方法：有研究表明，術(shù)后3～4周開始，促進(jìn)骨修復(fù)的生長(zhǎng)因子開始從效應(yīng)細(xì)胞以旁分泌等多種形式出胞表達(dá)，并持續(xù)至術(shù)后第12～14周，骨修復(fù)進(jìn)入骨性連接形成期，生長(zhǎng)因子的內(nèi)源性表達(dá)出現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)控，而術(shù)后第16周后，內(nèi)源性骨修復(fù)相關(guān)生長(zhǎng)因子的表達(dá)量與正常情況相比，沒有顯著差異。因此，本研究選擇了術(shù)后第4周～12周，采用了RT-PCR的方法，對(duì)同種異體骨移植和自體骨移植后的相關(guān)生長(zhǎng)因子的表達(dá)進(jìn)行考核，通過對(duì)生成的cDNA量進(jìn)行灰度分析，并與

11、統(tǒng)一的內(nèi)對(duì)照指標(biāo)進(jìn)行比較，得到各細(xì)胞因子的相對(duì)豐度，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分析骨形成相關(guān)因子的變化趨勢(shì)與可能的相互作用關(guān)系。本研究主要分為三個(gè)部分： 第一部分： 本部分研究的目的主要是制備同種異體骨和自體骨移植的動(dòng)物模型，為下一步提取骨痂總RNA奠定基礎(chǔ)。以成年雄性新西蘭大白兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分為同種異體骨移植組(30只)、自體骨移植組(30只)及取材組(10只)。然后將同種異體骨移植組和自體骨移植組，根據(jù)取材時(shí)間點(diǎn)

12、(術(shù)后第4、6、8、10、12周)分別再分為5組。從取材組橈骨處制備植入物，經(jīng)處理后，手術(shù)植入同種異體骨移植組橈骨處；從身體對(duì)側(cè)橈骨處制備植入物，經(jīng)處理后，手術(shù)植入另一側(cè)肢體前臂橈骨處。術(shù)后第4、6、8、10、12周，從手術(shù)處新生成骨痂分離取材，以備RNA提取。 通過對(duì)同種異體骨和自體骨移植的動(dòng)物模型的制備及取材，為下一步進(jìn)行RNA提取提供了實(shí)驗(yàn)對(duì)象。 第二部分： 本部分研究以移植兔橈骨為研究對(duì)象，分別于同種異體

13、骨和自體骨植入后4、6、8、10和12周取各組節(jié)段骨痂，提取總：RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)BMP-2、TGF-β和VEGF的mRNA表達(dá)。試驗(yàn)結(jié)果表明，通過萃取，成功獲得各種因子的總RNA，經(jīng)過紫外分光光度計(jì)定量，RNA產(chǎn)物的純度和濃度均較高。甲醛變性電泳結(jié)果顯示，各RNA條帶亮度高，28S、18S、5S條帶均較清晰，且28s條帶的亮度與18s條帶的比值均接近2倍，表明提取的總RNA基本沒有降解，有較好的完整性

14、。經(jīng)過兩步法擴(kuò)增，BMP、VEGF、TGF-β的DNA片段大小分別為250bp、420bp和500bp，β-actin為300bp DNA片段，均與預(yù)期結(jié)果吻合。本部分研究在成功抽提總RNA的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)引物，分別擴(kuò)增得到各生長(zhǎng)因子的cDNA，與預(yù)期片段大小一致，為統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提供了可靠的原始數(shù)據(jù)。 第三部分： 通過對(duì)上部分結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析，利用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，考核骨形成相關(guān)因子BMP-2、TGF-β和

15、VEGF的mRNA表達(dá)與骨移植后骨形成的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，并比較自體骨移植與同種異體骨在三種骨形成相關(guān)因子表達(dá)上的區(qū)別。 本研究的結(jié)論如下： 一、同種異體骨和自體骨移植后骨組織內(nèi)存在BMP2、TGF-β和VEGF的持續(xù)分泌表達(dá)，其表達(dá)趨勢(shì)呈現(xiàn)先上升后下降的特點(diǎn)，且均能在術(shù)后第8周達(dá)到峰值，提示在該時(shí)間點(diǎn)附近進(jìn)行術(shù)后干預(yù)，可能會(huì)取得良好的效果。 二、比較同種異體骨和自體骨移植兩個(gè)組別，多種骨形成相關(guān)因子的表達(dá)呈現(xiàn)出不

16、同的時(shí)間、組別敏感性：組別及時(shí)間兩個(gè)因素對(duì)于VEGF的表達(dá)不存在交互效應(yīng)，F(xiàn)=2.226，P=0.079>0.05，進(jìn)一步地，VEGF的表達(dá)在兩個(gè)組之間沒有顯著差異，F(xiàn)=0.002，P=0.965>0.05；組別及時(shí)間兩個(gè)因素對(duì)于BMP-2的表達(dá)不存在交互效應(yīng)，F(xiàn)=2.341，P=0.068>0.05，而BMP-2的表達(dá)在兩個(gè)組之間有顯著差異，F(xiàn)=10.340，P=0.002<0.05；TGF-β的表達(dá)受到時(shí)間變化及組別的影響，且存在交