ATP敏感性鉀通道對(duì)缺氧條件下海馬CA1區(qū)神經(jīng)元保護(hù)作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、背景對(duì)大部分的組織器官而言，氧是維持生命活動(dòng)的必需因素。機(jī)體對(duì)缺氧的反應(yīng)，缺氧耐受以及缺氧后的修復(fù)機(jī)制是國(guó)內(nèi)外生物學(xué)家和醫(yī)學(xué)家關(guān)注的課題。細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)可分為急性反應(yīng)和慢性反應(yīng)兩種。急性反應(yīng)主要依賴于氧敏感的離子通道，而慢性反應(yīng)主要依賴于缺氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子(hypoxia-induciblefactor，HIF)對(duì)酶、生長(zhǎng)因子以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。慢性缺氧是很多疾病共同的病理過(guò)程，包括動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、彌漫間質(zhì)性肺纖維化、

2、神經(jīng)退行性疾病、關(guān)節(jié)炎及老化。在細(xì)胞水平，缺氧能激活很多主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的存活能力。這些被激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要通過(guò)調(diào)節(jié)能影響基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的活性發(fā)揮它們的作用。其中的一些通路能增強(qiáng)細(xì)胞的存活，另外的一些則導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。 大腦是對(duì)缺氧最敏感的器官，它在缺氧狀態(tài)下的功能改變可以影響到全身的各個(gè)系統(tǒng)。ATP敏感性鉀通道是廣泛存在的一種離子通道，它分布于各種組織器官，如腦垂體、心肌、平滑肌、骨骼肌

3、和胰腺的β細(xì)胞，參與了多種細(xì)胞功能的調(diào)控，同時(shí)也涉及神經(jīng)元再生、死亡及細(xì)胞周期調(diào)控等過(guò)程。已有研究表明，在缺氧的情況下，ATP敏感性鉀通道有明顯的電生理方面的改變，并且KATP通道的激活對(duì)缺氧中的神經(jīng)元具有明顯的保護(hù)作用。然而，我們尚未清楚，在缺氧的狀態(tài)下，KATP通道的激活對(duì)神經(jīng)元保護(hù)作用的具體作用機(jī)制。因此，本研究是在離體培養(yǎng)海馬神經(jīng)元缺氧模型上研究細(xì)胞對(duì)惡劣環(huán)境因素的感知及其損傷信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，闡述損傷與適應(yīng)的機(jī)制，有助于建立

4、預(yù)警—預(yù)防—診斷—治療一體的干預(yù)體系。 目的：在缺氧誘導(dǎo)的離體培養(yǎng)海馬神經(jīng)元凋亡模型上探討神經(jīng)元損傷可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，進(jìn)一步闡明缺氧的病理生理過(guò)程，為神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)的缺血缺氧修復(fù)和治療，乃至腫瘤的治療提供新的策略。 方法：取出生1-2天SD大鼠，斷頭取腦，分離雙側(cè)海馬CA1區(qū)，機(jī)械分散細(xì)胞并制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)一周后，將細(xì)胞分為兩大組：第一組為正常對(duì)照組，細(xì)胞在正常氧狀態(tài)中(5％CO2、

5、95％空氣)孵育12小時(shí)、24小時(shí)，除空白對(duì)照外，分別給予KATP通道的激動(dòng)劑二氮嗪(100uM)，KATP通道的阻斷劑甲糖寧(100uM)，或用p53的阻斷劑曲古抑菌素trichostatin(TSA，25nM)預(yù)處理2h后再給予KATP通道的阻斷劑甲糖寧(100uM)；第二組為處理組，細(xì)胞在5％CO2、95％N2模擬的缺氧狀態(tài)孵育12小時(shí)、24小時(shí)，包含空白組，KATP通道激動(dòng)劑二氮嗪處理組，KATP通道阻斷劑甲糖寧處理組，及曲古抑

6、菌素預(yù)處理組。運(yùn)用Hoechst染色及MTT法比較常氧及缺氧狀態(tài)下，空白組及各個(gè)處理組對(duì)神經(jīng)元缺氧損傷的影響。運(yùn)用RT-PCR方法比較不同處理組神經(jīng)元p53mRNA的表達(dá)情況。采用RT-PCR及免疫印記方法檢測(cè)KATP通道在常氧和缺氧條件下表達(dá)水平的差異。 結(jié)果：數(shù)據(jù)表明，在慢性重度缺氧中，p53的表達(dá)較正常氧分壓下明顯升高(p＜0.05)。在常氧組與缺氧組內(nèi)我們分別給予神經(jīng)元KATP通道的阻斷劑甲糖寧(100uM)和KATP通

7、道的激動(dòng)劑二氮嗪(100uM)。結(jié)果顯示，在正常氧組，二者對(duì)p53mRNA表達(dá)水平的影響無(wú)顯著性差異；然而，在缺氧組，甲糖寧處理后，p53mRNA表達(dá)水平顯著增加(p＜0.05)，而二氮嗪處理后，p53mRNA水平較單純?nèi)毖踅M顯著降低(P＜0.05)，與正常組相比則無(wú)顯著差異(p＞0.05)。 在正常氧濃度培養(yǎng)條件下，神經(jīng)元中幾乎檢測(cè)不到DNA斷裂(正常培養(yǎng)12小時(shí)為2.2±1.3％，培養(yǎng)24小時(shí)為2.3±1.1％)，甲糖寧及二

8、氮嗪處理組亦對(duì)其無(wú)顯著影響(p＞0.05)。相反，在重度缺氧條件下，缺氧12小時(shí)后20.3±2.2％的神經(jīng)元出現(xiàn)細(xì)胞核損傷，缺氧24小時(shí)后31.6±1.7％的神經(jīng)元出現(xiàn)細(xì)胞核損傷。甲糖寧顯著增加神經(jīng)元細(xì)胞核損傷的比例(缺氧12小時(shí)為32.5±1.6％，缺氧24小時(shí)為45.7±3.4％)，而二氮嗪則減少細(xì)胞核損傷的比例(缺氧12小時(shí)為8.1±3.1％，缺氧24小時(shí)為18.4±2.3％)(p＜0.05，n=6)。 為了更好地說(shuō)明KA

9、TP通道的保護(hù)作用是通過(guò)抑制p53的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，我們采用曲古抑菌素(TSA)預(yù)處理細(xì)胞2h。曲古抑菌素能特異性的阻斷缺氧誘導(dǎo)的依賴p53的凋亡途徑。結(jié)果顯示，曲古抑菌素能完全阻斷缺氧條件下甲糖寧的促凋亡作用，而對(duì)正常氧濃度下的神經(jīng)元無(wú)顯著影響。 MTT細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示，以正常氧濃度培養(yǎng)條件下神經(jīng)元的存活率為100％計(jì)算，甲糖寧及二氮嗪對(duì)正常氧培養(yǎng)神經(jīng)元的存活率無(wú)顯著影響(p＞0.05)。而在重度缺氧條件下，神經(jīng)元的存活率顯著

10、降低(缺氧12小時(shí)為78.44±5.43％，缺氧24小時(shí)為69.91±4.32％)，二氮嗪能提高神經(jīng)元的存活率(缺氧12小時(shí)為88.44±6.52％，缺氧24小時(shí)為82.67±3.79％)，而甲糖寧則減少神經(jīng)元的存活率，但甲糖寧的這種作用同樣可被曲古抑菌素(TSA)逆轉(zhuǎn)。 為了進(jìn)一步了解KATP通道在缺氧中的作用，我們采用RT-PCR及免疫印記方法檢測(cè)KATP通道在常氧和缺氧條件下表達(dá)水平的差異。結(jié)果表明，KATP通道的SUR亞