中藥活性成分對腫瘤自殺基因旁殺傷效應(yīng)及GJIC的影響.pdf

1、惡性腫瘤是嚴重危害人類健康和生命的重大疾病。基因治療給惡性腫瘤患者帶來了曙光，國外已把基因治療作為惡性腫瘤常規(guī)治療無效后的一種標準治療嘗試。但十多年來基因治療的實驗和臨床研究結(jié)果表明，腫瘤基因治療遠未達到人們當初期望的那樣有效。自殺基因治療雖然存在旁殺傷機制，理論上能完全消除腫瘤細胞達到治愈的效果，但由于目前載體轉(zhuǎn)染效率較低、靶向性不夠等問題還沒有解決，因而未能達到預(yù)期的效果，且因病毒載體的使用等帶來了一定的毒副作用。如何有效地提高治療

2、效果，同時減少其毒副作用是目前仍須解決的關(guān)鍵問題?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有自殺基因系統(tǒng)都存在旁殺傷效應(yīng)，增強旁殺傷效應(yīng)能降低對高轉(zhuǎn)染率的需求，減少載體及前體藥物用量和毒性，增強基因治療系統(tǒng)對腫瘤殺傷力。因此，增強旁殺傷效應(yīng)目前已成為提高腫瘤基因治療療效的重要策略。產(chǎn)生旁殺傷效應(yīng)的主要機制有：縫隙連接細胞通訊(GapJunctionalIntercellularCommunication，GJIC)介導，細胞凋亡介導和免疫介導等。根據(jù)上述這

3、幾種機制，目前形成旁殺傷效應(yīng)的增效策略主要有：促進GJIC、誘導癌細胞凋亡，提高患瘤機體免疫力等。常用的技術(shù)手段包括基因轉(zhuǎn)染法及藥物誘導法。中藥是一個天然藥物寶庫，在促進腫瘤GJIC、誘導癌細胞凋亡或提高患瘤機體免疫功能等方面都有優(yōu)勢或潛力，且毒副作用相對較少，從中尋找自殺基因增效藥物，建立中西醫(yī)結(jié)合療法具有可行性。 研究目的意義：本課題選擇被報道有促細胞GJIC或誘導癌細胞凋亡作用的抑癌中藥成分芹黃素、白藜蘆醇、姜黃素，研究其

4、對自殺基因系統(tǒng)是否有協(xié)同增效作用，獲得有肯定作用的中藥成分，探討其通過GJIC或細胞凋亡機制增強自殺基因旁殺傷效應(yīng)的藥理靶點，闡明其增效的機理，為建立腫瘤基因治療聯(lián)合中醫(yī)藥療法，推進腫瘤基因治療的臨床應(yīng)用和抗癌中藥新藥開發(fā)打下基礎(chǔ)。 1.實驗方法：1.1中藥活性成分對自殺基因旁觀者效應(yīng)影響的體外篩選：MTT法體外檢測大鼠肝癌細胞CBRH7919對芹黃素、白藜蘆醇、姜黃素的敏感程度，以確定用藥濃度。選擇對細胞抑制率低的濃度進行實驗

5、。上述三種中藥活性成分各自以不同濃度與GCV分別或共同作用于大鼠肝癌CBRH7919的tk-細胞，以及含10％tk+細胞的tk+、tk-混合細胞，MTT檢測各組存活率，兩兩比較分析各組存活率的差異和旁觀者效應(yīng)大小，并用金正鈞Q值分析中藥與自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合的相互作用是否具有協(xié)同性。Q值為聯(lián)合用藥時實測藥效與理論藥效的比值，Q≤0.85為拮抗作用，0.85≤Q＜1.15為相加作用，q≥1.15為協(xié)同作用。 1.2對有效中藥成分對自殺

6、基因治療系統(tǒng)增效機制研究：分別用不同濃度的白藜蘆醇、姜黃素與GCV分別或共同作用于大鼠肝癌CBRH7919的tk-細胞以及含10％tk+細胞的tk+、tk-混合細胞，用流式細胞技術(shù)檢測凋亡指數(shù)，分析中藥成分對癌細胞周期的影響。MTT法檢測GJ抑制劑AGA對各組細胞的旁殺傷效應(yīng)的影響、SL/DT法觀察白藜蘆醇、姜黃素對CBRH7919的GJIC功能的影響、FITC間接免疫熒光法檢測細胞中Cx43的表達。 1.3HSV-tk綠色熒光

7、蛋白融合基因表達載體的構(gòu)建及表達實驗采用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒pLXSN-tk和pEGFP-N1。pLXSN-tk用EcoRI//BamHI雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳分離tkcDNA片段，回收后再用XmI酶切切除終止密碼，回收后為目的片段。pEGFP-N1用EcoRI/XmaI酶切后，回收大片段，將該大片段與目的基因片段混合，加入連接酶進行連接反應(yīng)后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，卡那霉素培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，篩選轉(zhuǎn)化子，進行擴增后提取質(zhì)粒，酶切鑒定和

8、序列測定；polyFect轉(zhuǎn)染液進行細胞轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡觀察基因表達情況，MTT法檢測轉(zhuǎn)化細胞對GCV的敏感性。 2.結(jié)果2.1中藥活性成分對自殺基因旁觀者效應(yīng)影響的體外篩選結(jié)果顯示：①芹黃素在50μM以上濃度才對大鼠肝癌細胞CBRH7919產(chǎn)生生長抑制作用，但50μM濃度對細胞的抑制效應(yīng)不高，抑制率只有20.8％。而聯(lián)合HSV-TK/GCV系統(tǒng)對肝癌細胞生長的影響研究結(jié)果表明，50μM的芹黃素對tk/GCV治療系統(tǒng)的增效作用具

9、有協(xié)同性，25μM濃度下的芹黃素聯(lián)合tk/GCV只顯示加和性的作用。 ②白藜蘆醇在25μM-100μM濃度下對大鼠肝癌細胞CBRH7919的生長都發(fā)揮較為明顯的抑制效應(yīng)，且作用呈時間和劑量依賴關(guān)系，藥物作用62h的IC50為45μM。說明白藜蘆醇對大鼠肝癌細胞有細胞毒作用。聯(lián)合HSV-tk/GCV系統(tǒng)對肝癌細胞生長的影響研究結(jié)果表明，10μM和25μM濃度下的白藜蘆醇聯(lián)合HSV-tk/GCV系統(tǒng)作用能顯著地提高GCV對tk+、t

10、k-混合細胞的殺傷率，金正鈞Q值＞1.15，具有明顯增強HSV-tk/GCV系統(tǒng)的旁殺傷效應(yīng)的作用，其增效作用具有協(xié)同性。其起效濃度低于芹黃素。白藜蘆醇對肝癌細胞中HSV-tk/GCV系統(tǒng)的影響在藥物作用8小時就已經(jīng)起效，而且在藥物去除后63小時仍能夠起到協(xié)同性增效的效果。 ③姜黃素在10μM-50μM濃度下對大鼠CBRH7919細胞的生長都發(fā)揮較為明顯的抑制效應(yīng)，藥物作用50h的IC50為24μM，且作用呈時間和劑量依賴關(guān)系。

11、說明姜黃素對大鼠肝癌細胞有較強的細胞毒作用。低濃度的姜黃素(5-10μM)聯(lián)合HSV-tk/GCV作用能顯著地提高GCV對tk+、tk-混合細胞的殺傷率，金正鈞Q值＞1.15，具有明顯增強HSV-tk/GCV的旁殺傷效應(yīng)的作用，其起效濃度低于芹黃素。其增效作用具有協(xié)同性。 2.2對上述中藥活性成分促進自殺基因旁殺傷效應(yīng)的機制進行了初步的研究，結(jié)果顯示：①流式細胞分析顯示，白藜蘆醇與HSV-tk/GCV治療系統(tǒng)聯(lián)用，可顯著提高大鼠

12、肝癌細胞的凋亡率，對其細胞周期無明顯影響；姜黃素與HSV-tk/GCV治療系統(tǒng)聯(lián)用，能使肝癌細胞的細胞周期阻滯在S期的細胞明顯增多，也能使細胞的凋亡率顯著升高。 ②細胞GJIC的長效抑制劑AGA對白藜蘆醇、姜黃素與HSV-tk/GCV各自組成的三聯(lián)系統(tǒng)的殺傷效應(yīng)具有顯著的下調(diào)作用。提示白藜蘆醇、姜黃素對HSV-tk/GCV系統(tǒng)旁殺傷效應(yīng)的增效作用機制可能都與細胞間縫隙連接細胞通訊有關(guān)。 ③SL/DT法對大鼠肝癌細胞CBR

13、H7919細胞間染料傳輸功能進行檢測的結(jié)果顯示細胞經(jīng)過白藜蘆醇、姜黃素處理后，細胞間隙連接通訊功能獲得增強。 ④)FITC間接免疫熒光法檢測Cx43結(jié)果顯示：大鼠CBRH7919細胞本身也有Cx43的弱表達，但白藜蘆醇、姜黃素對CBRH7919的Cx43的表達與成熟可能有促進作用。 2.3HSV-tk綠色熒光蛋白融合基因表達載體的構(gòu)建及表達實驗結(jié)果重組質(zhì)粒pTKGFP經(jīng)限制性酶切鑒定和DNA序列測定分析。結(jié)果顯示，TK基

14、因已經(jīng)成功與GFP基因連接，連接處的序列為：5'-gcccgggatceaccggtcgccaccatg-3’(5’端下劃線處為TK基因的連接處，3’端下劃線處為EGFP基因的連接處)，插入處的密碼閱讀框與GFP的密碼閱讀框吻合，無移碼突變產(chǎn)生。 將pTKGFP和pEGFP-N1和pDsRed2-N1轉(zhuǎn)染細胞24h后在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示，TK-GFP融合基因、EGFP和DsRed2在B16，NIH313，CBRH7919

15、中都獲得表達。pDsRed2轉(zhuǎn)染的細胞表達紅色熒光，熒光彌散分布于整個細胞(細胞質(zhì)、核中)。pEGFP-N1轉(zhuǎn)染的細胞表達綠色熒光，熒光也彌散分布于整個細胞(細胞質(zhì)、核中)，而pTKGFP轉(zhuǎn)染的細胞雖然也表達出綠色熒光，但熒光主要聚集在細胞核中，其在細胞中的定位與文獻資料關(guān)于TK在細胞中的定位描述一致，說明作為示蹤的融合蛋白不僅能表達，而且能夠在細胞內(nèi)正確折疊、定位。 GCV對TKGFP組和EGFP組細胞的殺傷效應(yīng)結(jié)果顯示，TK

16、GFP組細胞對GCV的敏感性大于對照EGFP組細胞，差異有顯著性。說明本研究構(gòu)建的融合表達載體具有TK功能，而且使用GFP融合蛋白技術(shù)研究胸苷激酶的細胞內(nèi)的表達和定位是可行的。 3.結(jié)論3.1本研究在細胞水平實驗探討了中藥活性成分白藜蘆醇，芹黃素和姜黃素增強自殺基因療法療效的可行性。發(fā)現(xiàn)三者能有效增強自殺基因?qū)δ[瘤細胞殺傷力，提高旁觀者效應(yīng)，而且是協(xié)同性增效作用。其中白藜蘆醇和姜黃素的起效濃度小于芹黃素。對其機制研究分析表明，其

17、作用機制很可能都是通過增強CBRH7919細胞的GJIC或誘導凋亡、調(diào)節(jié)細胞周期等來起到增效作用的，也可能是兩個機制都起作用。 3.2構(gòu)建了pTKGFP融合蛋白基因表達載體，并成功在CBRH7919、B16、NIH3T3中進行表達，所表達的融合蛋白具有TK活性和EGFP的熒光活性，可用于后續(xù)性的體外與體內(nèi)實驗，為建立熒光活體成像技術(shù)，更科學地進行腫瘤自殺基因增效中藥/成分的研究打下基礎(chǔ)。 今后將在待選中藥中繼續(xù)篩選更多針