中藥活性成分對(duì)腫瘤自殺基因旁殺傷效應(yīng)及GJIC的影響.pdf

1、惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和生命的重大疾病?；蛑委熃o惡性腫瘤患者帶來(lái)了曙光，國(guó)外已把基因治療作為惡性腫瘤常規(guī)治療無(wú)效后的一種標(biāo)準(zhǔn)治療嘗試。但十多年來(lái)基因治療的實(shí)驗(yàn)和臨床研究結(jié)果表明，腫瘤基因治療遠(yuǎn)未達(dá)到人們當(dāng)初期望的那樣有效。自殺基因治療雖然存在旁殺傷機(jī)制，理論上能完全消除腫瘤細(xì)胞達(dá)到治愈的效果，但由于目前載體轉(zhuǎn)染效率較低、靶向性不夠等問(wèn)題還沒(méi)有解決，因而未能達(dá)到預(yù)期的效果，且因病毒載體的使用等帶來(lái)了一定的毒副作用。如何有效地提高治療

2、效果，同時(shí)減少其毒副作用是目前仍須解決的關(guān)鍵問(wèn)題。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有自殺基因系統(tǒng)都存在旁殺傷效應(yīng)，增強(qiáng)旁殺傷效應(yīng)能降低對(duì)高轉(zhuǎn)染率的需求，減少載體及前體藥物用量和毒性，增強(qiáng)基因治療系統(tǒng)對(duì)腫瘤殺傷力。因此，增強(qiáng)旁殺傷效應(yīng)目前已成為提高腫瘤基因治療療效的重要策略。產(chǎn)生旁殺傷效應(yīng)的主要機(jī)制有：縫隙連接細(xì)胞通訊(GapJunctionalIntercellularCommunication，GJIC)介導(dǎo)，細(xì)胞凋亡介導(dǎo)和免疫介導(dǎo)等。根據(jù)上述這

3、幾種機(jī)制，目前形成旁殺傷效應(yīng)的增效策略主要有：促進(jìn)GJIC、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，提高患瘤機(jī)體免疫力等。常用的技術(shù)手段包括基因轉(zhuǎn)染法及藥物誘導(dǎo)法。中藥是一個(gè)天然藥物寶庫(kù)，在促進(jìn)腫瘤GJIC、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡或提高患瘤機(jī)體免疫功能等方面都有優(yōu)勢(shì)或潛力，且毒副作用相對(duì)較少，從中尋找自殺基因增效藥物，建立中西醫(yī)結(jié)合療法具有可行性。 研究目的意義：本課題選擇被報(bào)道有促細(xì)胞GJIC或誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡作用的抑癌中藥成分芹黃素、白藜蘆醇、姜黃素，研究其

4、對(duì)自殺基因系統(tǒng)是否有協(xié)同增效作用，獲得有肯定作用的中藥成分，探討其通過(guò)GJIC或細(xì)胞凋亡機(jī)制增強(qiáng)自殺基因旁殺傷效應(yīng)的藥理靶點(diǎn)，闡明其增效的機(jī)理，為建立腫瘤基因治療聯(lián)合中醫(yī)藥療法，推進(jìn)腫瘤基因治療的臨床應(yīng)用和抗癌中藥新藥開(kāi)發(fā)打下基礎(chǔ)。 1.實(shí)驗(yàn)方法：1.1中藥活性成分對(duì)自殺基因旁觀者效應(yīng)影響的體外篩選：MTT法體外檢測(cè)大鼠肝癌細(xì)胞CBRH7919對(duì)芹黃素、白藜蘆醇、姜黃素的敏感程度，以確定用藥濃度。選擇對(duì)細(xì)胞抑制率低的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

5、。上述三種中藥活性成分各自以不同濃度與GCV分別或共同作用于大鼠肝癌CBRH7919的tk-細(xì)胞，以及含10％tk+細(xì)胞的tk+、tk-混合細(xì)胞，MTT檢測(cè)各組存活率，兩兩比較分析各組存活率的差異和旁觀者效應(yīng)大小，并用金正鈞Q值分析中藥與自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合的相互作用是否具有協(xié)同性。Q值為聯(lián)合用藥時(shí)實(shí)測(cè)藥效與理論藥效的比值，Q≤0.85為拮抗作用，0.85≤Q＜1.15為相加作用，q≥1.15為協(xié)同作用。 1.2對(duì)有效中藥成分對(duì)自殺

6、基因治療系統(tǒng)增效機(jī)制研究：分別用不同濃度的白藜蘆醇、姜黃素與GCV分別或共同作用于大鼠肝癌CBRH7919的tk-細(xì)胞以及含10％tk+細(xì)胞的tk+、tk-混合細(xì)胞，用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)凋亡指數(shù)，分析中藥成分對(duì)癌細(xì)胞周期的影響。MTT法檢測(cè)GJ抑制劑AGA對(duì)各組細(xì)胞的旁殺傷效應(yīng)的影響、SL/DT法觀察白藜蘆醇、姜黃素對(duì)CBRH7919的GJIC功能的影響、FITC間接免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞中Cx43的表達(dá)。 1.3HSV-tk綠色熒光

7、蛋白融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)實(shí)驗(yàn)采用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒pLXSN-tk和pEGFP-N1。pLXSN-tk用EcoRI//BamHI雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳分離tkcDNA片段，回收后再用XmI酶切切除終止密碼，回收后為目的片段。pEGFP-N1用EcoRI/XmaI酶切后，回收大片段，將該大片段與目的基因片段混合，加入連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，卡那霉素培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，篩選轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，酶切鑒定和

8、序列測(cè)定；polyFect轉(zhuǎn)染液進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡觀察基因表達(dá)情況，MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)GCV的敏感性。 2.結(jié)果2.1中藥活性成分對(duì)自殺基因旁觀者效應(yīng)影響的體外篩選結(jié)果顯示：①芹黃素在50μM以上濃度才對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞CBRH7919產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制作用，但50μM濃度對(duì)細(xì)胞的抑制效應(yīng)不高，抑制率只有20.8％。而聯(lián)合HSV-TK/GCV系統(tǒng)對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響研究結(jié)果表明，50μM的芹黃素對(duì)tk/GCV治療系統(tǒng)的增效作用具

9、有協(xié)同性，25μM濃度下的芹黃素聯(lián)合tk/GCV只顯示加和性的作用。 ②白藜蘆醇在25μM-100μM濃度下對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞CBRH7919的生長(zhǎng)都發(fā)揮較為明顯的抑制效應(yīng)，且作用呈時(shí)間和劑量依賴(lài)關(guān)系，藥物作用62h的IC50為45μM。說(shuō)明白藜蘆醇對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞有細(xì)胞毒作用。聯(lián)合HSV-tk/GCV系統(tǒng)對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響研究結(jié)果表明，10μM和25μM濃度下的白藜蘆醇聯(lián)合HSV-tk/GCV系統(tǒng)作用能顯著地提高GCV對(duì)tk+、t

10、k-混合細(xì)胞的殺傷率，金正鈞Q值＞1.15，具有明顯增強(qiáng)HSV-tk/GCV系統(tǒng)的旁殺傷效應(yīng)的作用，其增效作用具有協(xié)同性。其起效濃度低于芹黃素。白藜蘆醇對(duì)肝癌細(xì)胞中HSV-tk/GCV系統(tǒng)的影響在藥物作用8小時(shí)就已經(jīng)起效，而且在藥物去除后63小時(shí)仍能夠起到協(xié)同性增效的效果。 ③姜黃素在10μM-50μM濃度下對(duì)大鼠CBRH7919細(xì)胞的生長(zhǎng)都發(fā)揮較為明顯的抑制效應(yīng)，藥物作用50h的IC50為24μM，且作用呈時(shí)間和劑量依賴(lài)關(guān)系。

11、說(shuō)明姜黃素對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用。低濃度的姜黃素(5-10μM)聯(lián)合HSV-tk/GCV作用能顯著地提高GCV對(duì)tk+、tk-混合細(xì)胞的殺傷率，金正鈞Q值＞1.15，具有明顯增強(qiáng)HSV-tk/GCV的旁殺傷效應(yīng)的作用，其起效濃度低于芹黃素。其增效作用具有協(xié)同性。 2.2對(duì)上述中藥活性成分促進(jìn)自殺基因旁殺傷效應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行了初步的研究，結(jié)果顯示：①流式細(xì)胞分析顯示，白藜蘆醇與HSV-tk/GCV治療系統(tǒng)聯(lián)用，可顯著提高大鼠

12、肝癌細(xì)胞的凋亡率，對(duì)其細(xì)胞周期無(wú)明顯影響；姜黃素與HSV-tk/GCV治療系統(tǒng)聯(lián)用，能使肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在S期的細(xì)胞明顯增多，也能使細(xì)胞的凋亡率顯著升高。 ②細(xì)胞GJIC的長(zhǎng)效抑制劑AGA對(duì)白藜蘆醇、姜黃素與HSV-tk/GCV各自組成的三聯(lián)系統(tǒng)的殺傷效應(yīng)具有顯著的下調(diào)作用。提示白藜蘆醇、姜黃素對(duì)HSV-tk/GCV系統(tǒng)旁殺傷效應(yīng)的增效作用機(jī)制可能都與細(xì)胞間縫隙連接細(xì)胞通訊有關(guān)。 ③SL/DT法對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞CBR

13、H7919細(xì)胞間染料傳輸功能進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示細(xì)胞經(jīng)過(guò)白藜蘆醇、姜黃素處理后，細(xì)胞間隙連接通訊功能獲得增強(qiáng)。 ④)FITC間接免疫熒光法檢測(cè)Cx43結(jié)果顯示：大鼠CBRH7919細(xì)胞本身也有Cx43的弱表達(dá)，但白藜蘆醇、姜黃素對(duì)CBRH7919的Cx43的表達(dá)與成熟可能有促進(jìn)作用。 2.3HSV-tk綠色熒光蛋白融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果重組質(zhì)粒pTKGFP經(jīng)限制性酶切鑒定和DNA序列測(cè)定分析。結(jié)果顯示，TK基

14、因已經(jīng)成功與GFP基因連接，連接處的序列為：5'-gcccgggatceaccggtcgccaccatg-3’(5’端下劃線處為T(mén)K基因的連接處，3’端下劃線處為EGFP基因的連接處)，插入處的密碼閱讀框與GFP的密碼閱讀框吻合，無(wú)移碼突變產(chǎn)生。 將pTKGFP和pEGFP-N1和pDsRed2-N1轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示，TK-GFP融合基因、EGFP和DsRed2在B16，NIH313，CBRH7919

15、中都獲得表達(dá)。pDsRed2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)紅色熒光，熒光彌散分布于整個(gè)細(xì)胞(細(xì)胞質(zhì)、核中)。pEGFP-N1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，熒光也彌散分布于整個(gè)細(xì)胞(細(xì)胞質(zhì)、核中)，而pTKGFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞雖然也表達(dá)出綠色熒光，但熒光主要聚集在細(xì)胞核中，其在細(xì)胞中的定位與文獻(xiàn)資料關(guān)于TK在細(xì)胞中的定位描述一致，說(shuō)明作為示蹤的融合蛋白不僅能表達(dá)，而且能夠在細(xì)胞內(nèi)正確折疊、定位。 GCV對(duì)TKGFP組和EGFP組細(xì)胞的殺傷效應(yīng)結(jié)果顯示，TK

16、GFP組細(xì)胞對(duì)GCV的敏感性大于對(duì)照EGFP組細(xì)胞，差異有顯著性。說(shuō)明本研究構(gòu)建的融合表達(dá)載體具有TK功能，而且使用GFP融合蛋白技術(shù)研究胸苷激酶的細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位是可行的。 3.結(jié)論3.1本研究在細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)探討了中藥活性成分白藜蘆醇，芹黃素和姜黃素增強(qiáng)自殺基因療法療效的可行性。發(fā)現(xiàn)三者能有效增強(qiáng)自殺基因?qū)δ[瘤細(xì)胞殺傷力，提高旁觀者效應(yīng)，而且是協(xié)同性增效作用。其中白藜蘆醇和姜黃素的起效濃度小于芹黃素。對(duì)其機(jī)制研究分析表明，其

17、作用機(jī)制很可能都是通過(guò)增強(qiáng)CBRH7919細(xì)胞的GJIC或誘導(dǎo)凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等來(lái)起到增效作用的，也可能是兩個(gè)機(jī)制都起作用。 3.2構(gòu)建了pTKGFP融合蛋白基因表達(dá)載體，并成功在CBRH7919、B16、NIH3T3中進(jìn)行表達(dá)，所表達(dá)的融合蛋白具有TK活性和EGFP的熒光活性，可用于后續(xù)性的體外與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，為建立熒光活體成像技術(shù)，更科學(xué)地進(jìn)行腫瘤自殺基因增效中藥/成分的研究打下基礎(chǔ)。 今后將在待選中藥中繼續(xù)篩選更多針