具有腫瘤殺傷活性粒細(xì)胞的篩選及其體外抑瘤效應(yīng)研究.pdf

1、粒細(xì)胞(Granulocytes)是指帶有分葉核和豐富的胞質(zhì)顆粒的細(xì)胞，是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，粒細(xì)胞主要在抵御微生物攻擊中發(fā)揮作用，而在抗腫瘤免疫中作用則不大。近年來(lái)一系列動(dòng)物模型的研究證據(jù)表明，某些小鼠來(lái)源的粒細(xì)胞具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，提示粒細(xì)胞作為新型抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞的潛力。但是動(dòng)物模型中一的發(fā)現(xiàn)是否適用于人類，能否從在健康人群中篩選出具有腫瘤殺傷活性(cancer killer activity，CKA)的粒細(xì)

2、胞，從而應(yīng)用于腫瘤臨床治療，是一個(gè)有待探討的問(wèn)題。為此，我們從21名健康志愿者的全血中分離粒細(xì)胞，篩選出CKA粒細(xì)胞，初步研究CKA粒細(xì)胞的體外抗腫瘤作用及機(jī)制，并探討人CKA細(xì)胞群體與不具有CKA粒細(xì)胞群體的分子差異，為腫瘤的細(xì)胞治療提供新思路。
　　 目的：從21個(gè)樣本中篩選CKA粒細(xì)胞，確定篩選獲得的CKA粒細(xì)胞的體外抑瘤效應(yīng)及抗腫瘤的可能機(jī)制，探討人源CKA細(xì)胞群體與不具有腫瘤殺傷活性粒細(xì)胞群體的分子差異。
　　

3、 方法：
　　 1、CKA粒細(xì)胞的篩選：收集21份健康志愿者外周抗凝全血，從中分離粒細(xì)胞；分別將其與人肺癌A549細(xì)胞共培養(yǎng)，應(yīng)用CC-K-8法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖活性，篩選CKA粒細(xì)胞。
　　 2、CKA粒細(xì)胞的體外抗腫瘤作用：通過(guò)CCK-8法，分別檢測(cè)在不同效靶比、直接接觸的共培養(yǎng)條件下，篩選獲得的CKA粒細(xì)胞對(duì)正常人細(xì)胞株、腫瘤細(xì)胞株的體外殺傷作用。
　　 3、CKA粒細(xì)胞的體外抗腫瘤機(jī)制：在不同效靶比、直接接

4、觸的共培養(yǎng)條件下，通過(guò)雙染法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡；分別采用直接接觸、Transwell共培養(yǎng)、條件培養(yǎng)液等共培養(yǎng)細(xì)胞方式，比較不同處理方式下，CKA粒細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。
　　 4、CKA細(xì)胞與不具有CKA粒細(xì)胞的差異分析：分別應(yīng)用Real time PCR與ELISA的方法檢測(cè)CKA粒細(xì)胞與不具有CKA粒細(xì)胞之間TGFβ1 mRNA表達(dá)量及蛋白含量的差異；應(yīng)用TGFβ受體抑制劑Ly-364947阻斷TGFβ1受體，觀察處理后

5、粒細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、21個(gè)樣本中，有6個(gè)樣本粒細(xì)胞克隆對(duì)肺癌細(xì)胞株A549具有明顯的抑制作用，CKA的比例為28.57%，其中克隆3對(duì)A549的抑制作用最強(qiáng)。
　　 2、克隆3的CKA粒細(xì)胞對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、人肝癌細(xì)胞HepG2和人宮頸癌細(xì)胞Hela具有明顯抑制作用，而對(duì)正常人成纖維細(xì)胞株MRC-5基本無(wú)抑制作用；CKA粒細(xì)胞的抑瘤效應(yīng)隨著效靶比的提高而增強(qiáng)。
　　 3、

6、在直接接觸后，克隆3的CKA粒細(xì)胞能誘導(dǎo)A549、HepG2、Hela細(xì)胞凋亡；三種處理方式的抑制效率比較：直接接觸>Transwell>條件培養(yǎng)。
　　 4、相對(duì)于不具有腫瘤殺傷活性粒細(xì)胞，CKA粒細(xì)胞中TGFβ1表達(dá)量(包括RNA水平與蛋白水平)顯著性降低(P<0.05)；經(jīng)TGFβ受體抑制劑(LY-364947)處理，CKA粒細(xì)胞的抗腫瘤作用增強(qiáng)；其增強(qiáng)效應(yīng)與抑制劑使用濃度正相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1、

7、與動(dòng)物模型的結(jié)果類似，一定比例人體內(nèi)也存在著CKA粒細(xì)胞。
　　 2、CKA粒細(xì)胞對(duì)不同腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞的殺傷作用具有一定選擇性。
　　 3、CKA粒細(xì)胞能高效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷需要直接接觸。相對(duì)于不具有腫瘤殺傷活性粒細(xì)胞，CKA粒細(xì)胞中TGFβ1表達(dá)量低，抑制TGFβ1有助于增強(qiáng)CKA粒細(xì)胞的抗腫瘤作用。
　　 4、CKA粒細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用可能與其對(duì)腫瘤細(xì)胞的趨化、粘附作用有關(guān)。<