神經(jīng)生長(zhǎng)因子和血清素在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用.pdf

1、眾所周知，骨折愈合需要較長(zhǎng)時(shí)間。有統(tǒng)計(jì)資料[1]表明約有5％～10％骨折患者愈合能力差，發(fā)生骨折延遲愈合或不愈合，影響患肢功能，甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥。臨床觀察和研究表明骨折愈合具有加速潛力。骨折加速愈合以及異位骨化在骨折合并顱腦外傷患者中普遍存在[2]。顱腦損傷后釋放到血液循環(huán)中未知的體液因素可增強(qiáng)成骨作用[3]。
　　 神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nervegrowthfactor，NGF)和血清素(Serotonin)均屬于重要的神經(jīng)遞質(zhì)

2、。腦外傷后，機(jī)體通過(guò)一定的途徑，上調(diào)了NGF的水平和下調(diào)了血清素的水平，從而在加速骨折愈合的過(guò)程中起到重要作用[4]。研究證實(shí)在正常骨組織和骨折骨痂組織中均有NGF及其受體的表達(dá)。局部給予NGF后，發(fā)現(xiàn)其對(duì)骨折愈合具有明顯的加速愈合的作用。研究中證實(shí)[5]:在成骨細(xì)胞，骨細(xì)胞，成纖維細(xì)胞中5-HT(2b)受體mRNA均有表達(dá)。新的研究發(fā)現(xiàn)血清素也可以抑制骨質(zhì)的流失。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BoneMarrowStemCell，BMSCs)在一

3、定條件下可向成骨細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化[6]。Boes等[7]發(fā)現(xiàn)顱腦外傷病人血清中的成骨細(xì)胞因子可以促進(jìn)未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞有絲分裂向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而加速骨折的愈合。本實(shí)驗(yàn)旨在研究神經(jīng)生長(zhǎng)因子和血清素在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)成中所起的作用，進(jìn)一步揭示骨折合并腦外傷后骨折加速愈合的機(jī)制，并為今后預(yù)防和治療骨折延遲愈合、不愈合和預(yù)防老年性骨質(zhì)疏松方面提供新的思路。
　　 目的:研究神經(jīng)生長(zhǎng)因子和血清素在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞

4、轉(zhuǎn)化過(guò)成中所起的作用，進(jìn)一步揭示骨折合并腦外傷后骨折加速愈合的機(jī)制，并為今后在預(yù)防和治療骨折延遲愈合、不愈合和預(yù)防老年性骨質(zhì)疏松方面提供新的思路。
　　 方法:本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrowstromalstemcells，BMSCs)。將其培養(yǎng)至第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，在向成骨誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的過(guò)程中加入血清素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子這兩種干擾因素，觀察成骨細(xì)胞變化。
　　

5、1、樣品制備
　　 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，按1×105/L的濃度分別接種在8只培養(yǎng)瓶中，每組4只共分為1和2兩個(gè)組，分別培養(yǎng)14天和21天。在1組中A1為對(duì)照組細(xì)胞僅用條件培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)10％的胎牛血清FBS，低糖DMEM培養(yǎng)基，0.1μmol/L地塞米松，50mg/L抗壞血酸，10mmol/Lβ-磷酸甘油鈉，100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化。B1為NGF組，C1為血清素組，D1為NGF

6、和血清素組。2組中A2為對(duì)照組細(xì)胞僅用條件培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)10％FBS低糖DMEM培養(yǎng)基，0.1μmol/L地塞米松，50mg/L抗壞血酸，10mmol/Lβ-磷酸甘油鈉，100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化。B2為NGF組，C2為血清素組，D2為NGF和血清素組。
　　 2、檢測(cè)方法
　　 2.1、Westernblotting檢測(cè)Ⅰ型膠原蛋白(TypeⅠcollagen)
　　 2.2、酶聯(lián)

7、免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)法定量分析骨鈣素(Osteocalcin)分泌量
　　 2.3、免疫組化方法定性分析鈣化結(jié)節(jié)
　　 2.4、酶標(biāo)儀法檢測(cè)堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase)活性
　　 結(jié)果:誘導(dǎo)后14天酶標(biāo)儀法檢測(cè)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性均增加D1＞B1＞C1＞A1(P＜0.01)。免疫組化方法定性分析鈣化結(jié)節(jié)均呈現(xiàn)陽(yáng)性。Westernblot-tin定量檢測(cè)Ⅰ型膠原蛋白D1＞B1＞C1