賁門癌蛋白指紋模型的建立與腫瘤相關(guān)標(biāo)志物的篩選.pdf

1、背景與目的：賁門癌（Gastric cardia adenocarcinoma，GCA）是我國(guó)北方常見的惡性腫瘤之一，80年代以來，我國(guó)胃遠(yuǎn)側(cè)部位腫瘤發(fā)生率呈明顯下降趨勢(shì)，但GCA發(fā)病率仍維持在較高水平。研究提示，賁門癌變是一多階段、多因素參與的過程。SELDI-TOF-MS技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種蛋白組學(xué)研究方法。具有樣品用量小、操作簡(jiǎn)便、高靈敏度、高通量等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)篩選出眾多的標(biāo)志物。為GCA的研究提供了重要技術(shù)平臺(tái)。關(guān)于GCA的

2、蛋白質(zhì)組學(xué)研究報(bào)道很少。本研究采用SELDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)GCA患者和健康人的血清進(jìn)行檢測(cè)，以期建立GCA蛋白診斷模型；并對(duì)GCA不同分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行蛋白質(zhì)組對(duì)比分析，以期發(fā)現(xiàn)與其密切相關(guān)的標(biāo)志物。在上述基礎(chǔ)上本研究利用生物學(xué)信息及RT-PCR技術(shù)查詢并確定GCA相關(guān)蛋白，尋找能輔助GCA早期診斷的標(biāo)志物。 材料與方法：GCA患者：47例，男36例，平均年齡61±8歲；女11例，平均年齡61±10歲。所有患者術(shù)

3、前均未經(jīng)放療和化療，并排除急慢性炎癥（肝炎等）等。術(shù)后病理檢查均為賁門腺癌，合并有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例。健康對(duì)照組：50例，男29例，平均年齡56±11歲；女21例，平均年齡60±10歲。取空腹靜脈血2-5ml，4℃靜置1-2h，2000r/min離心30min，將血清100μl分裝后-80℃冰箱保存。組織標(biāo)本20例（10例為GCA組織，10例為對(duì)應(yīng)的癌旁正常賁門組織），男6例，女4例，平均年齡60±7歲。 取10μl血清樣品，加2

4、0μl U9（9M尿素，2％CHAPS，50mM Tris-HCl調(diào)到pH9.0）緩沖液，4℃振蕩30min，使蛋白變性。取上清液10μl加120μl結(jié)合緩沖液（50mM NaAC，PH3.5）震蕩混勻5min備用。每孔依次加入50μl 100mmol/LCuSO4，50μl 100mmol/L醋酸鈉（pH4.0），150μl結(jié)合/洗脫緩沖液（50mmol/LHEPES，pH7.0），最后每孔加入50μl稀釋好的樣品，4℃孵育60min

5、后除去，緩沖液沖洗。取出芯片風(fēng)干，備檢。利用PBS II型蛋白質(zhì)芯片閱讀儀進(jìn)行檢測(cè)，蛋白質(zhì)的分子量區(qū)間為1500-20000Da。采用加有All-in-one標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的NP20芯片校正質(zhì)譜儀，設(shè)定儀器參數(shù)，在CipherGen ProteinChip軟件中設(shè)定程序讀取芯片數(shù)據(jù)，由計(jì)算機(jī)根據(jù)所獲得的原始數(shù)據(jù)繪制出蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖，縱坐標(biāo)為蛋白質(zhì)相對(duì)含量，橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比。 候選相關(guān)蛋白質(zhì)檢索：根據(jù)差異蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量，在SWI

6、SS-PROT和TrEMBL蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中通過http://us.expasy.org/tools/tagident.html網(wǎng)站檢索與其相匹配蛋白質(zhì)，分子量允許的誤差范圍<0.5％。 RT-PCR技術(shù)：RNA提取及反轉(zhuǎn)錄分別按Promega公司SV Total RNA Isolation System及ImProm-IITM Reverse Transcription System試劑盒建議進(jìn)行。PCR引物由上海生物工程公司合成

7、Gastric cancer-related protein（VRG118）forward：5'- GGC TCC ATG GTC TGA GTT GT-3 '，reverse：5'- TTA ATA CCA CTC CCC CAA CG-3'，擴(kuò)增片段為194bp。反應(yīng)體系為10×Reaction buffer 2μl，10mmol/L dNTPs 2μl，25mmol/L MgCl2 1.6μl，forward primer 0.8

8、μl，reverse primer 0.8μl，Taq DNA Polymerase 0.1μl，Template DNA 2μl，Sterile deionized Water 10.7μl，共20μl。條件為：95℃預(yù)變性3min，（94℃30s，60℃35s，72℃45s）30個(gè)循環(huán)，72℃延伸8min。產(chǎn)物經(jīng)1％的普通瓊脂糖凝膠電泳后，溴化乙啶染色，通過凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果。 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有檢測(cè)數(shù)據(jù)先用P

9、roteinchip Software 3.1進(jìn)行統(tǒng)一校正，使總離子強(qiáng)度及分子量均一化。再用Biomarker Wizard軟件方差分析，計(jì)算不同組相同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)含量的P值。P <0.05被認(rèn)為差異具有顯著性。各組間蛋白表達(dá)差異等數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用X2檢驗(yàn)和Kappa檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果：以M5908.48，M7943.64和M8938.70蛋白質(zhì)組成的決策樹模型對(duì)GCA患者測(cè)

10、試的準(zhǔn)確率、敏感度和特異度分別為77.3％、85.1％和70.0％。差異蛋白中相對(duì)分子質(zhì)量為M4211.29，M5334.13，M5966.63，M5903.14，M11735.71，M5922.70，M7932.54，M7758.66，M9287.40和M6109.99的蛋白質(zhì)（上調(diào)組蛋白）相對(duì)含量在3組中比較為：對(duì)照組<中分化組<低分化組；相對(duì)分子質(zhì)量為M8992.89，M8158.48，M8924.27，M4495.96，M943

11、4.40，M5099.02，M6661.72，M6222.12和M6960.60的蛋白質(zhì)（下調(diào)組蛋白）相對(duì)含量在3組中比較為：對(duì)照組>低分化組>中分化組。相對(duì)分子質(zhì)量（M/Z）為M7762.68的蛋白質(zhì)在GCA組中的含量明顯高于健康對(duì)照組，根據(jù)其相對(duì)分子質(zhì)量在SWISS-PROT和TrEMBL蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢，發(fā)現(xiàn)VRG118，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果最為符合。RT-PCR檢測(cè)顯示VRG118在10例GCA組織中4例為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為：40％（4/10