小麥高分子量谷蛋白亞基1Bx13和1By16單克隆抗體制備及其應用研究.pdf

1、小麥的烘烤品質不僅與貯藏蛋白的含量有關，而且還與其組成有關。烘烤品質的測定通常需要比較昂貴的儀器，如：粉質儀、拉伸儀、和面儀等，這些儀器難以在各育種單位普及。另外，利用上述儀器進行分析時，需要較大的樣品量，這在育種的早代難以實現。雖然沉淀值、凱氏定N等方法較為經濟，但其效率卻較低。最近，酶聯免疫吸附測定法(ELISA)，因具有成本低、耗費少、所需樣品量少以及樣品處理簡單等優(yōu)點，已開始用于品質預測和篩選。利用這種方法測定小麥品質，關鍵是要

2、制備適宜的抗體，尤其是單克隆抗體。研究表明，HMW-GS1Bx13和1By16是對烘烤品質影響較大的優(yōu)質亞基，因此，制備這兩個亞基的單克隆抗體更有應用價值。而且，由于這兩個亞基的基因還未克隆，以1Bx13和1By16亞基為抗原制備單克隆抗體還可以用于篩選cDNA表達文庫，從而克隆這兩個亞基及其它貯藏蛋白基因。 本研究以斯卑爾脫小麥Somiedo為材料，分別采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、酸性聚丙烯酰胺凝

3、膠電泳(A-PAGE)、雙向A-PAGE×SDS-PAGE、等電聚焦×SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(IEF×SDS-PAGE)、高效毛細管電泳(HPCE)、高效液相色譜(HPLC)以及基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)等方法對高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)進行分離鑒定。采用電泳法分離純化1Bx13和1By16亞基，并以這兩個亞基為抗原免疫BALB/C小鼠，采用雜交瘤技術制備相應抗原的單克隆抗體，并采用間接ELI

4、SA方法結合SPSS軟件分析，研究所制備單克隆抗體在預測小麥烘烤品質及亞基鑒定方面的應用。另外，還進行了HMW-GS及LMW-GS抗原表位分析。主要研究結果如下： 1.HMW-GS的分離鑒定。目前，用于HMW-GS分離鑒定的方法較多，其中，以PAGE方法最為經濟。雙向電泳(2-DE)的分辨率最高，且可對蛋白質的等電點進行研究。HPLC不僅可用于分離鑒定，還可回收純化單個亞基，但所需流動相量大，儀器比較昂貴，分析成本較高。HPCE

5、相對于HPLC來說較為經濟，與PAGE相比可以避免有毒藥品的使用，因此是一種比較理想的分離鑒定HMW-GS的方法。本研究中的斯卑爾脫小麥Somiedo含有五個HMW-GS(1，13+16，2+12)，均能利用上述方法進行分離鑒定。2-DE分析結果表明，從等電點來看，該品種所含有的HMW-GS主要分布在堿性區(qū)域，而且1Bx13和1By16較其它三條亞基的堿性更強。通過質譜技術(MALDI-TOF-MS)獲得了1Bx13和1By16亞基的精

6、確分子量，分別為82.9249kD和77.0525kD。 2.1Bx13和1By16亞基的回收純化。特定HMW-GS的回收純化常用的方法有電泳法、電洗脫法以及反相高效液相色譜(RP-HPLC)法，其中以電泳法最為經濟，其次是電洗脫法，RP-HPLC法效率最高，但所需儀器及費用都比較昂貴。本研究以電泳法回收純化HMW-GS1Bx13和1By16，取得了較好的效果。 3.單克隆抗體的制備與鑒定?？贵w最常用的方法，本研究分別以

7、HMW-GS1Bx13和1By16為抗原，制備了4株單克隆抗體，分別命名為24231、24245、14587和14588。同13個小麥品種谷蛋白的免疫印跡結果顯示：以1Bx13亞基為抗原所獲得的兩株單克隆抗體24231和24245均與LMW-GS反應強烈，而與HMW-GS反應較弱；以1By16亞基為抗原所獲得的單克隆抗體14588與LMW-GS及部分HMW-GS反應強烈，而與其它HMW-GS反應較弱。另一株單抗14587與MW-GS1D

8、x的反應明顯高于LMW-GS，而與其它HMW-GS無反應。 4.單克隆抗體在小麥品質預測及亞基鑒定中的應用。單抗-麥谷蛋白ELISA吸附值與小麥品質性狀的相關性分析表明，所制備單克隆抗體與不同小麥品質參數之間有一定的相關性，但因抗體、性狀及提取劑的不同而存在差異。就抗體而言，以24231和24245與品質性狀的相關性最為密切，其次是14588，而抗體14587與所測品質性狀無相關性。其中，抗體24231的ELISA吸附值與形成時

9、間呈顯著負相關，相關系數為-0.583，與穩(wěn)定時間呈極顯著負相關，相關系數為-0.723；抗體24245的ELISA吸附值與形成時間和延伸性均呈顯著負相關，相關系數分別為-0.775和-0.686；抗體14588的ELISA吸附值與穩(wěn)定時間呈顯著正相關，相關系數為0.625。就小麥品質參數而言，以形成時間和穩(wěn)定時間與抗體的相關程度最高，其次是延伸性，而沉淀值、最大抗阻力以及蛋白含量在本實驗中則無相關性。提取劑以酸化醇法效果較好，其次是鹽

10、酸法、SDS法和正丙醇法，但最佳提取劑還因抗體的不同而略有差異。例如，抗體24231在以3％SDS為提取劑時與品質性狀的相關性最高，抗體14588則以鹽酸法為提取劑時與品質性狀的相關性最高。由以上結果可以看出，這些抗體可作為有效的工具用于小麥品質預測。 單抗14587同粗山羊草的反應初步研究結果表明，該抗體與含有5+10亞基的粗山羊草之間反應的ELISA吸附值明顯較含有2+12亞基的粗山羊草之間反應的ELISA吸附值高，經SPS

11、S軟件分析，差異達到顯著性水平。因此，該抗體有望用于區(qū)分含5+10亞基和2+12亞基的粗山羊草，在遠緣雜交中的優(yōu)質亞基鑒定與篩選等方面具有一定的利用價值。 5.HMW-GS及LMW-GS抗原表位分析。通過對13個常見HMW-GS以及21個面包小麥和硬粒小麥LMW-GS基因編碼蛋白的抗原表位分析，獲得HMW-GS、LMW-GS以及不同HMW-GS分別特有的抗原表位，可作為合成多肽抗原制備特異單克隆或多克隆抗體的依據，有助于提高所制