粗山羊草高分子量麥谷蛋白新亞基基因的克隆、分子進(jìn)化及其遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、小麥高分子量麥谷蛋白亞基(high molecular weight glutenin,HMW-GS)是籽粒貯藏蛋白的重要組分。HMW-GS的組成和含量直接影響和決定著小麥的加工品質(zhì)。粗山羊草(Aegilops tauschii, DD,2n=2x=14)是普通小麥六倍體的D基因組的供體,存在豐富的HMW-GS的變異類型,且大多是現(xiàn)有普通小麥中不存在的新類型,是普通小麥品質(zhì)改良的一個(gè)重要基因資源。因此從粗山羊草中分離克隆這些新的HMW-

2、GS基因,不僅為粗山羊草與普通小麥的進(jìn)化關(guān)系提供更多的遺傳信息,而且能夠?yàn)槠胀ㄐ←溒焚|(zhì)改良提供基因資源并拓寬普通小麥的遺傳多樣性。本文以粗山羊草為材料,對(duì)三個(gè)新的HMW-GS基因進(jìn)行了克隆、序列比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析,并對(duì)1Dx1.1t基因進(jìn)行了原核表達(dá)和基因槍轉(zhuǎn)化。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)一個(gè)新的x-型HMW-GS基因的分子克隆、原核表達(dá)及其系統(tǒng)進(jìn)化分析
　　通過(guò)對(duì)山羊草種子儲(chǔ)藏蛋SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的H

3、MW-GS,其在遷移率比亞基1Ax1的稍慢,我們將其命名為1Dx1.1t。利用等位基因特異性 PCR(Allele specific PCR, AS-PCR)方法對(duì)其基因編碼區(qū)進(jìn)行了分離。1Dx1.1t基因全長(zhǎng)為2628 bp,編碼874個(gè)氨基酸,是目前山羊草中分子量最大的HMW-GS基因。原核表達(dá)結(jié)果表明1Dx1.1t基因表達(dá)蛋白與種子中相應(yīng)的谷蛋白亞基遷移率相同,這說(shuō)明所克隆基因確實(shí)是1Dx1.1t亞基的編碼基因。序列比較結(jié)果表明1

4、Dx1.1t與其它Dx型亞基高度相似,但也具有其它Dx型亞基不具有的新穎特征。首先,在其它Dx型亞基的N-末端都有的一個(gè)保守的三肽序列(LQE),而在1Dx1.1t的相應(yīng)的區(qū)域是不存在的;其次,在1Dx1.1t中部重復(fù)區(qū)域有3個(gè)三肽重復(fù)的結(jié)構(gòu)域(GQQGQQ)以及一個(gè)新的三肽(GQL)。系統(tǒng)分析結(jié)果表明亞基1Dx1.1t與其它Dx型亞基優(yōu)先地聚在一起和至少有三種基因型的粗山羊草參與普通小麥的形成。
　　(2)兩個(gè)新的x-型HMW-

5、GS基因的分離、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及其系統(tǒng)進(jìn)化分析
　　利用AS-PCR法方法克隆了兩個(gè)新的y-型HMW-GS基因,分別命名為1Dy12.5t和1Dy9.5t。1Dy12.5t基因編碼的蛋白在 SDS-PAGE上的電泳遷移率遠(yuǎn)快于亞基1Dy12,而1Dy9.5t基因編碼的蛋白的電泳遷移率處于亞基1Dy10和1By9之間。1Dy12.5t基因全長(zhǎng)為2650 bp,其中編碼區(qū)長(zhǎng)度為1788 bp和上游區(qū)域長(zhǎng)度為862 bp;1Dy9.5t基

6、因編碼區(qū)長(zhǎng)度為1995 bp,是目前分子量最大的 Dy型亞基基因。y-型HMW-GS基因上游區(qū)域的核苷酸序列比較結(jié)果1Dy12.5t基因具有其它y-型HMW-GS基因上游區(qū)域的保守區(qū)域,顯示其是一個(gè)有轉(zhuǎn)錄活性的基因,但在其啟動(dòng)子(ATG)與CCACC序列之間有一個(gè)5 bp(ACGAG)的插入,這個(gè)5 bp的插入是在已知的HMW-GS基因中所沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的。亞基1Dy12.5t和1Dy9.5t具有典型y型亞基的結(jié)構(gòu)特征。亞基1Dy12.5t與

7、1Dy13t高度相似只有9個(gè)氨基酸殘基的差別;而1Dy9.5t與1Dy12.4t和1Dy高度相似,分別有2和4個(gè)氨基酸殘基的差別。通過(guò)比較1Dy9.5t與1Dy12.4t基因序列發(fā)現(xiàn)可能是由于在1Dy9.5t基因第806和1478位的兩個(gè)16 bp核苷酸正向重復(fù)引起224個(gè)氨基酸殘基的缺失而導(dǎo)致1Dy12.4t基因的產(chǎn)生。在1Dy12.5t基因編碼區(qū)內(nèi)分別檢測(cè)到5個(gè)SNPs,其中3個(gè)SNPs引起氨基酸殘基的改變;在1Dy9.5t基因編碼