組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA、DP與紫杉醇協同對非小細胞肺癌的抑制作用和機制.pdf

1、目的：探討組蛋白去乙?；敢种苿┡c紫杉醇聯合應用，協同抑制NSCLC細胞系的作用和機制。 方法：1.采用體外藥物敏感試驗(MTT比色法)，分別觀察不同給藥時間TSA、DP和紫杉醇協同對NSCLC細胞系A549、H322及H1299的抑制作用；實驗共分設10組：①正常對照組(contro1)；②紫杉醇96h組(TAX)；③DP12h組(DP)；④DP作用12h后換為紫杉醇84h組(DF)，12h時換培養(yǎng)液；⑤DP與紫杉醇同時加用組

2、(DTST)，DP與紫杉醇同時加入培養(yǎng)基中，12h換液，去除DP，紫杉醇繼續(xù)作用84h；⑥紫杉醇作用84h后換為DP作用12h組(DB)，84h時換培養(yǎng)液；⑦TSA12h組(TSA)；⑧TSA作用12h換為紫杉醇84h組(TF)，12h時換培養(yǎng)液；⑨TSA+紫杉醇同時加用組(TTST)，TSA作用12h，紫杉醇再作用84h，12h時換培養(yǎng)液；⑩紫杉醇作用84h后換為TSA作用12h組(TB)，84h時換培養(yǎng)液；聯合用藥時每孔TSA用藥濃

3、度為300nM，DP用藥濃度為25ng/ml，觀察TSA、DP分別與紫杉醇聯合應用對H1299和H322細胞系的協同抑制效果。2.采用流式細胞儀檢測TSA、DP分別與紫杉醇聯合應用早期對H1299和H322細胞系的細胞周期、細胞凋亡的變化。分組方法同方法1，紫杉醇作用時間調整為24h。TSA用藥濃度為300nM，DP用藥濃度為25ng/ml，紫杉醇用藥濃度為10uM。3.采用Western免疫印跡法檢測聯合應用早期p21、survivi

4、n、磷酸化ERK以及PARP蛋白的表達變化，按方法2的分組進行。另外還檢測了A549、H322及H1299細胞系的HER2表達水平。5.熒光顯微鏡下觀察按方法3的分組方法，各組Hoechst染色后細胞核的變化，了解凋亡和細胞死亡情況。 結果：1.NSCLC3種細胞系HER2蛋白表達水平不同，表達水平由高到低依次為H322、A549和H1299。2.HDAC抑制劑TSA、DP對體外培養(yǎng)的3種NSCLC細胞系均具有生長抑制作用，并且

5、這種抑制作用呈現時間依賴性和劑量依賴性。并且TSA、DP對3種細胞系的IC50值與HER2蛋白表達水平不相關。TSA和DP對表達野生型p53的A549較對其它兩種細胞系的敏感性高。3.紫杉醇對3種NSCLC細胞均有明顯的生長抑制作用。紫杉醇對H322、H1299、A549細胞系的的IC50值分別為28.07nm(r=0.95)、110.6(r=0.92)、9.81nm(r=0.97)。紫杉醇的IC50值同樣與HER2的表達水平沒有關系。

6、4.與紫杉醇聯合應用3組中，DP與TSA均提高了紫杉醇抑制細胞生長的水平，但根據CI分析的方法，先用和后用TSA、DP的TF、DF、DB組抑制曲線的各點CI值均＜1，提示TSA先用及DP先用和后用的聯合方法達到了協同效應。同時應用TSA、DP的TTST、DTST及后用TSA的TB組部分點CI值＜1。提示DP聯合應用紫杉醇，三種聯合方法都能提高紫杉醇的細胞生長抑制作用，但先用TSA、DP的方法較后兩種方法更顯示了協同效果。5.TSA、DP

7、及紫杉醇單獨應用，均明顯地誘導H1299和H322細胞系的p21蛋白的表達增加；在H1299細胞系，聯合應用DP和紫杉醇，較單獨應用紫杉醇p21表達水平進一步增加；聯合應用TSA和紫杉醇，先用及后用TF、TB組較單獨應用紫杉醇p21表達水平進一步增加，但同時應用TTST組卻較單獨應用紫杉醇組p21蛋白表達水平下降明顯；在H322細胞系，除先用DP的DF組p21表達與TAX組相近外，其余各聯合應用組，p21蛋白表達均較TAX組明顯下降，以

8、TF、TTST、TB組下降為明顯。6.TSA誘導H1299和H322細胞系發(fā)生G1期細胞周期阻滯，DP誘導H1299細胞G1期，而誘導H322細胞G2期細胞周期阻滯。先后應用TSA、DP與紫杉醇的聯合應用主要發(fā)生G1期阻滯，而同時應用則出現G2期細胞周期阻滯。聯合應用后G2的細胞周期阻滯與p21蛋白表達相對下調有關。7.TSA、DP與紫杉醇的聯合應用后在H322細胞系可以檢測到Caspase3活化后剪切的PARP蛋白，聯合應用組較單獨應

9、用組剪切的PARP蛋白水平明顯增加。同時流式細胞檢測聯合應用組較單獨應用，細胞凋亡增加。而在H1299細胞系未檢測到剪切的PARP蛋白，流式細胞檢測聯合應用組較單獨應用，細胞凋亡增加，但凋亡比率小。8.紫杉醇能誘導NSCLC細胞系H1299和H322的survivin的蛋白高表達，HDAC抑制劑TSA、DP不僅能下調NSCLC細胞系H1299和H322原有survivin的蛋白表達，而且能抑制紫杉醇誘發(fā)的survivin高表達。9.紫杉

10、醇能激活NSCLC細胞系H1299和H322的ERK信號通路，HDAC抑制劑TSA、DP不僅能下調NSCLC細胞系H1299和H322磷酸化ERK蛋白的表達水平，而且能抑制ERK通路的激活。 結論：1.HDAC抑制劑TSA和DP都能抑制3種NSCLC細胞系的生長，而這種生長抑制作用與HER2的表達水平之間沒有明顯的關系。TSA和DP對NSCLC細胞系的生長抑制作用的強弱與p53基因的形態(tài)有一定關系，表達野生型p53的細胞系較表達

11、突變型p53基因的細胞系更為敏感。p53的基因形態(tài)可能是預測HDAC敏感性的指標之一。而p53基因的變異對紫杉醇的敏感性可能沒有影響。2.HDAC抑制劑TSA、DP與化療藥物紫杉醇聯合應用，可以提高紫杉醇對NSCLC細胞系H1299和H322的生長抑制功能，按HDAC抑制劑的應用順序，HDAC抑制劑先用的方法可以達到協同效果。 3.TSA誘導H1299和H322細胞系發(fā)生G1期細胞周期阻滯，DP誘導H1299細胞G1期，而誘導H

12、322細胞G2期細胞周期阻滯。先后應用TSA、DP與紫杉醇的聯合應用主要發(fā)生G1期阻滯，而同時應用則出現G2期細胞周期阻滯。聯合應用后G2期的細胞周期阻滯與p21蛋白表達相對下調有關。4.聯合應用的協同作用在H322細胞系，表現為細胞凋亡的增加，而在H1299細胞系，則可能存在非凋亡因素。5.HDAC抑制劑與紫杉醇的協同抑制細胞生長的效應與p53的狀態(tài)無關。HER2的表達水平也不是協同治療敏感性的指標。6.紫杉醇能誘發(fā)NSCLC細胞系H

13、1299和H322的survivin的蛋白高表達，HDAC抑制劑TSA、DP不僅能下調NSCLC細胞系H1299和H322原有survivin的蛋白表達，而且能抑制紫杉醇誘發(fā)的survivin高表達。上述作用可能是HDAC抑制劑聯合紫杉醇協同抑制肺癌細胞的機制之一。 7.紫杉醇能激活NSCLC細胞系H1299和H322的ERK信號通路，HDAC抑制劑TSA、DP不僅能下調NSCLC細胞系H1299和H322磷酸化ERK蛋白的表達