大鼠EPCs的標記方法及TBI大鼠外周血中的EPCs的變化趨勢.pdf

1、目的：本研究組前期臨床觀測發(fā)現(xiàn)顱腦創(chuàng)傷(TBI)患者外周血中內(nèi)皮祖細胞(EPCs)數(shù)量存在著先降低后上升的變化特征，為了進一步研究外周血中EPCs變化機理，須建立相關的動物研究平臺。本研究目的：1.建立一種大鼠外周血中EPCs的分離、標記方法，使用流式細胞儀(FCM)雙抗體標記技術檢測大鼠外周血中EPCs的數(shù)量；2.利用大鼠液壓顱腦創(chuàng)傷(FPI)模型，探明TBI后大鼠外周血中EPCs的變化趨勢；3.探討TBI后EPCs與白細胞、血小板的

2、相關變化趨勢，為研究TBI后外周血中EPCs的變化機理提供參考。 方法：1.使用健康成年雄性WISTER大鼠共45只(體重300-350g，鼠齡12周)，分為假手術對照組(n=10)及TBI組(n=35)。假手術對照組大鼠僅給予10％水合氯醛腹腔注射麻醉。TBI組使用液壓打擊儀及小動物立體定向儀，分別建立輕、中、重型大鼠閉合性顱腦液壓損傷模型，輕型組(n=10)液壓打擊力度為1atm，中型組(n=10)液壓打擊力度為2atm，重

3、型組(n=15)液壓打擊力度為3atm；2.TBI后24h，按照隨機原則從各TBI組中各抽取2只大鼠分別進行頭顱MR檢查和腦組織切片HE染色，觀察TBI的影像和病理特征。其余大鼠分別于傷前24h和傷后不同時間點(3h、6h、24h、48h、72h、240h、336h)使用硬質(zhì)玻璃毛細采血管(()=1mm)取大鼠內(nèi)眥球后靜脈叢血液約1.1ml，進行外周血EPCs測定，同時使用小動物外周血細胞檢測設備進行白細胞和血小板測定；3.采用Fico

4、ll密度梯度離心法分離大鼠外周血單個核細胞，以CD34、CD133雙抗體陽性作為EPCs標志，使用CD34、CD133雙抗體標記結合流式細胞計數(shù)方法，檢測大鼠外周血中EPCs的數(shù)量。 結果：對照組10只大鼠完成了各時間點大鼠外周血循環(huán)中相應指標測定；輕型TBI組中1只大鼠因打擊后3天頭部切口感染被剔除，其余7只大鼠完成了各時間點大鼠外周血循環(huán)中相應指標測定；中型TBI組中1只大鼠于打擊后48h死亡，其余7只大鼠完成了各時間點大鼠

5、外周血循環(huán)中相應指標測定；重型TBI組中2只于打擊后24h死亡，4只于打擊后48h死亡，其中1只因眼內(nèi)眥取血處嚴重感染被剔除，其余7只大鼠完成了各時間點大鼠外周血循環(huán)中相應指標測定；實驗中途死亡大鼠(n=6)的相應數(shù)據(jù)作為死亡組進行分析。1.大鼠外周血循環(huán)中存在表達CD34、CD133雙陽性的EPCs，本研究測定顯示：正常大鼠外周血循環(huán)中EPCs為33-61個/20萬單個核細胞，平均為47個/20萬單個核細胞；2.TBI后大鼠外周血中E

6、PCs數(shù)量在傷后下降至正常水平以下，于傷后3h達最低點，至10-30個/20萬單個核細胞，各組間下降幅度無顯著差異；3.TBI后大鼠外周血中EPCs數(shù)量在傷后3-6h漸升高至正常水平以上，于傷后6h達最高點，輕型組平均升至80個/20萬單個核細胞，中型組平均升至68個/20萬單個核細胞，重型組平均升至51個/20萬單個核細胞，此后EPCs逐漸下降，傷后24h各組EPCs均降至正常水平；TBI后死亡的大鼠外周血中EPCs在傷后3h也下降至

7、最低點，在傷后3-6h雖有上升趨勢，但達不到正常水平，死亡前外周血中EPCs呈持續(xù)下降趨勢；4.TBI后大鼠外周血中EPCs數(shù)量變化與血小板、白細胞數(shù)量均無顯著相關。 結論：1.采用CD34、CD133雙抗體標記技術結合使用流式細胞儀檢測、可以良好地定量測定大鼠外周血中的EPCs；2.本實驗顯示：與TBI患者傷后外周血中EPCs的變化特征相似，TBI后存活的大鼠外周血的EPCs水平同樣存在先降低，后增高，再逐漸降至正常的變化特征