血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的制備及其治療股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、意義： 股骨頭缺血性壞死是臨床多發(fā)病和常見病，其壞死的根本原因是血供障礙，并呈進(jìn)行性發(fā)展，引發(fā)股骨頭壞死，致殘率極高。目前，臨床對該病還沒有一個很好的治療方法。因此，研究一種新的治療股骨頭壞死的方法和藥物具有重大的意義。 血管損傷、炎癥導(dǎo)致的血管栓塞和骨內(nèi)壓升高是造成缺血性股骨頭壞死惡性循環(huán)的重要原因，這是股骨頭壞死治療中的難點(diǎn)。因此，抗炎、減壓同時恢復(fù)受損血管功能并建立新的側(cè)枝循環(huán)是打破股骨頭壞死病理惡性循環(huán)最有效的手

2、段。新血管的生成與多種生長因子的調(diào)節(jié)有關(guān)，它包括血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子(IGF-1)、血小板樣生長因子(PDGF)等多種蛋白因子。在眾多的血管生成刺激因子中以VEGF最為重要，它對血管的生長有很強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，是目前所知唯一特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的一種生長因子，

3、由于它還具有增強(qiáng)血管通透性的功能，又被稱為血管通透因子。VEGF作為血管生成的一種直接效應(yīng)分子已被用于冠心病防治的實(shí)驗(yàn)研究，近年來的研究還顯示VEGF能加速創(chuàng)傷性骨的修復(fù)及傷口的愈合，因此，VEGF在缺血性疾病的治療方面有潛在的臨床應(yīng)用價值。由于VEGF天然來源非常有限，產(chǎn)量甚微，遠(yuǎn)不能滿足臨床應(yīng)用的需要，因此利用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)VEGF很有必要。 目的： 通過建立激素誘導(dǎo)的兔股骨頭壞死動物模型，采用脂質(zhì)體對VEGF1

4、21包裹，制成脂質(zhì)體VEGF緩釋制劑，直接經(jīng)皮穿刺介入法，將脂質(zhì)體VEGF緩釋制劑注入股骨頭壞死部位，促進(jìn)新血管的生成，同時應(yīng)用特異性抗炎因子TNF-α拮抗劑TNFR-Fc對壞死股骨頭進(jìn)行消炎，變股骨頭壞死的惡性循環(huán)為良性性循。為臨床股骨頭壞死的治療提供新的治療策略和方法。 利用RT-PCR技術(shù)，從HL60細(xì)胞中擴(kuò)增出hVEGF121cDNA，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-24a(+)VEGF121，利用大腸桿菌BL21(DE3)高效

5、表達(dá)hVEGF121蛋白，并建立hVEGF121工程菌的高密度發(fā)酵工藝及目標(biāo)蛋白質(zhì)復(fù)性與純化工藝，制備符合臨床要求的生物制劑。 方法： 選取20只新西蘭白兔，隨機(jī)分成兩組，每組10只，A組用馬血清和醋酸潑尼松龍?jiān)炷?，B組為正常組，用夾心ELISA法測定股骨頭壞死模型中兔血清TNF-α濃度的變化，并對激素性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制及病理表現(xiàn)作初步探討。從HL60細(xì)胞中提取mRNA，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增hVEGF121cDN

6、A，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-24a(+)VEGF121，通過酶切、氨基酸序列測定對質(zhì)粒pET-24a(+)VEGF121分析鑒定，將原核表達(dá)質(zhì)粒pET-24a(+)VEGF121轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，通過IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE凝膠電泳篩選高表達(dá)陽性細(xì)胞株。采用搖瓶及發(fā)酵罐發(fā)酵，對影響工程菌生長及目的蛋白表達(dá)的因素如培養(yǎng)基、誘導(dǎo)時間及補(bǔ)料進(jìn)行優(yōu)化。采用等容超濾法對包涵體形式的蛋白質(zhì)進(jìn)行復(fù)性，并對目標(biāo)蛋白質(zhì)純化條件進(jìn)行探討

7、，采用DEAE-SepharoseFF柱陰離子交換色譜，SephacrylS-100凝膠過濾色譜純化目標(biāo)蛋白，應(yīng)用HUVEC細(xì)胞株測定VEGF121生物活性。用二次乳化法制備VEGF121脂質(zhì)體。選取30只新西蘭大白兔，實(shí)驗(yàn)分4組，A組(VEGF/TNFR治療組)：隨機(jī)選取10只模型兔左側(cè)股骨頭為VEGF/TNFR治療組；B組(VEGF治療組)：選取另外10只模型兔左側(cè)股骨頭為VEGF治療組；C組(對照組)：采用自身對側(cè)自然修復(fù)右側(cè)股骨

8、頭為對照組；D組(正常對照組)，采用直接經(jīng)皮穿刺介入法給藥。通過影像學(xué)方法：X光片、CT片及血管造影，觀察骨密度、股骨頭形態(tài)及新生血管的變化。通過病理切片HE染色，免疫組化，觀察空缺骨陷窩、新生血管、造血組織中脂肪細(xì)胞的變化，通過上述方法綜合評價VEGF121/TNFR治療激素誘導(dǎo)的兔股骨頭壞死的治療效果。 結(jié)果： 經(jīng)影像學(xué)觀察，模型組股骨頭關(guān)節(jié)面不完整，骨質(zhì)結(jié)構(gòu)不均一。病理學(xué)組織分析顯示，模型組股骨頭空缺骨陷窩增多，部

9、分血管出現(xiàn)栓塞，骨髓腔造血組織減少，脂肪細(xì)胞增多。免疫組化顯示關(guān)節(jié)組織中VEGF的表達(dá)減少。采用夾心ELISA法測定股骨頭壞死模型中兔血清TNF-α濃度的變化，結(jié)果顯示：模型組兔血清中TNF-α濃度明顯升高(p＜0.01)。獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測序，基因序列同文獻(xiàn)報道一致，利用大腸桿菌BL21(DE3)高效表達(dá)了hVEGF121蛋白，SDS-PAGE顯示hVEGF121蛋白的表達(dá)率大于20％，Westernblot結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物具

10、有hVEGF121抗原性。運(yùn)用hVEGF121工程菌高密度發(fā)酵工藝發(fā)酵，得到菌體量68g/L，目標(biāo)蛋白的表達(dá)量達(dá)菌體蛋白總量的23％，運(yùn)用hVEGF121蛋白質(zhì)的復(fù)性、純化方法，包涵體復(fù)性后純度達(dá)到80％以上，回收率超過50％。經(jīng)DEAE-sepharoseFF柱陰離子交換層析，SephacrylS-100凝膠過濾層析，得到的目的蛋白純度達(dá)95％以上。采用HUVEC細(xì)胞株MTT法對VEGF121的生物學(xué)活性進(jìn)行了測定，結(jié)果表明VEGF1

11、21能夠呈劑量依賴性地刺激HUVEC細(xì)胞的增殖，ED50為15ng/ml，具有天然VEGF的生物學(xué)活性。采用二次乳化法制備VEGF121脂質(zhì)體，其包裹率為54％。應(yīng)用脂質(zhì)體VEGF121、TNFR治療激素誘導(dǎo)股骨頭壞死，經(jīng)影像學(xué)觀察，股骨頭壞死區(qū)明顯修復(fù)。病理組織學(xué)分析顯示，骨組織空缺骨陷窩減少，出現(xiàn)新生血管，骨髓腔中造血組織明顯增多。免疫組化顯示，關(guān)節(jié)組織中VEGF的表達(dá)增多。 結(jié)論： 1、成功建立了激素性兔股骨頭壞死

12、模型，模型組兔血清中TNF-α濃度明顯升高，推測TNF-α在激素誘導(dǎo)股骨頭壞死中起重要作用。 2、應(yīng)用原核表達(dá)載體pET-24a(+)VEGF121，利用大腸桿菌BL21(DE3)成功高效表達(dá)了rhVEGF121。 3、該文建立了rhVEGF121工程菌高密度發(fā)酵工藝，大大提高工程菌的產(chǎn)量和目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)效率。 4、采用兩種變性溶解劑體系溶解，等容超濾的復(fù)性方法復(fù)性hVEGF121是該研究所首創(chuàng)，結(jié)果表明該復(fù)性

13、方法能提高以包涵體形式表達(dá)的蛋白質(zhì)的復(fù)性效率。 5、采用DEAE-sepharoseFF陰離子交換柱層析，SephacrylS-100凝膠過濾層析純化rhVEGF121是切實(shí)可行的。 6、采用直接穿刺介入法注射VEGF121/TNFR治療缺血性股骨頭壞死是一種可行的方法，VEGF治療組壞死區(qū)股骨頭明顯修復(fù)，出現(xiàn)新生血管，空缺骨陷窩減少，骨髓腔中造血組織明顯增多。rhVEGF121/TNFR聯(lián)合應(yīng)用治療股骨頭壞死，空缺骨陷