異種抗原neu-Fc聯(lián)合GM-CSF-IFN-γ和BCG的抗腫瘤免疫效應(yīng).pdf

1、人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2/neu)是表皮生長(zhǎng)因子受體家族的第二號(hào)成員，是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜受體蛋白，在25％～30％的乳腺癌中過(guò)表達(dá)，在正常組織中低表達(dá)，是良好的腫瘤免疫生物治療的靶分子。但HER2屬自身蛋白，機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)于過(guò)表達(dá)的自身蛋白往往處于耐受狀態(tài)，此外腫瘤細(xì)胞在長(zhǎng)期發(fā)展過(guò)程中在腫瘤局部形成了一個(gè)深度免疫抑制微環(huán)境，免疫細(xì)胞的作用

2、在這個(gè)微環(huán)境中受到抑制。打破機(jī)體對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的耐受、解除腫瘤局部的抑制狀態(tài)、誘發(fā)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)是腫瘤免疫治療的關(guān)鍵。 目的： 探討異種抗原蛋白neu-Fc聯(lián)合hGM-CSF和BCG的免疫調(diào)節(jié)作用；探討異種抗原蛋白neu-Fc聯(lián)合IFN-γ和BCG產(chǎn)生的抗腫瘤免疫效應(yīng)。 方法： 通過(guò)基因工程技術(shù)將大鼠neu L2-S2功能域與人IgG Fc區(qū)編碼序列融合，構(gòu)建真核表達(dá)載體：在CHO細(xì)胞中獲得穩(wěn)定表達(dá)

3、，應(yīng)用rProtein A Sepharose Fast Flow親和層析純化neu-Fc融合蛋白，應(yīng)用SDS-PAGE和Western blot鑒定重組蛋白；Ficoll法分離人PBMC，MTT法檢測(cè)融合蛋白對(duì)PBMC的促增殖作用；通過(guò)ELISA法檢測(cè)IL-12和IL-10水平的變化；FACS檢測(cè)單核細(xì)胞膜表面相關(guān)分子的變化；LDH法檢測(cè)PBMC在異種蛋白聯(lián)合佐劑刺激下對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用；pcDNA3.0/HER2轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌細(xì)胞E

4、MT6，獲得一株高表達(dá)HER2分子的EMT6/HER2細(xì)胞株；建立小鼠動(dòng)物模型，觀察佐劑和異種蛋白聯(lián)合對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響；HE染色腫瘤組織切片。 結(jié)果： Neu-Fc是分子量約為66 kDa的蛋白；PBMC經(jīng)MCF-7細(xì)胞上清誘導(dǎo)后，分泌IL-12的水平降低，分泌IL-10的水平顯著升高；10 nM neu-Fc對(duì)PBMC具有顯著的促增殖作用；Neu-Fc與佐劑聯(lián)合作用可顯著上調(diào)IL-12表達(dá)，下調(diào)IL-10表達(dá)；異種蛋白

5、聯(lián)合佐劑作用下，單核細(xì)胞表面MHC分子表達(dá)上調(diào)；異種蛋白聯(lián)合佐劑刺激PBMC后，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用增強(qiáng)；EMT6/HER2細(xì)胞HER2表達(dá)率為99.59％；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，異種蛋白聯(lián)合佐劑對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用：腫瘤組織切片HE染色中可以觀察到，與對(duì)照組相比，異種蛋白聯(lián)合佐劑組的腫瘤組織內(nèi)和包膜周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。 結(jié)論： 異種抗原蛋白neu-Fc聯(lián)合hGM-CSF和BCG對(duì)Th1類和Th2類免疫反應(yīng)有顯著的調(diào)節(jié)作用