BCG提取物抗腫瘤及免疫學(xué)調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：比較活BCG和滅活BCG對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞的增殖作用；提取、分離、純化和鑒定BCG的有效組分，通過(guò)分析有效組分對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖作用的影響，誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的作用，誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的作用來(lái)探討其有效組分的免疫調(diào)節(jié)活性；通過(guò)檢測(cè)其有效組分誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)人膀胱癌細(xì)胞株T24細(xì)胞的殺傷活性和吞噬活性來(lái)探討有效組分的抗腫瘤機(jī)制，為膀胱癌的治療開(kāi)發(fā)一種療效好、副作用少的生物制劑提

2、供科學(xué)依據(jù)。 方法：1.采用MTT法測(cè)定活BCG和滅活BCG對(duì)人淋巴細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞的增殖作用。2.采用酶裂解法和超聲波破碎法對(duì)活BCG進(jìn)行裂解，提取其活性蛋白質(zhì)，并用紫外比色法測(cè)定其蛋白純度，用考馬斯亮蘭方法測(cè)定其提取物的蛋白含量，通過(guò)葡聚糖凝膠層析方法對(duì)BCG提取物進(jìn)行組分分離并測(cè)定其分子量。進(jìn)一步采用SDS-PAGE凝膠電泳方法對(duì)層析后的BCG提取物進(jìn)行純度及分子量的鑒定。3.采用MTT法分析BCG提取物BCGE1、BCG

3、E2和BCGE3對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖作用的影響，并用ELISA方法檢測(cè)經(jīng)BCGE1、BCGE2和BCGE3作用后誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞分泌IL-12、TNF-α和IL-4等細(xì)胞因子的含量；用Gress方法檢測(cè)經(jīng)BCGE1、BCGE2、BCGE3作用后誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO水平。4.采用MTT法測(cè)定BCG有效組分BCGE2誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)人膀胱癌細(xì)胞株T24細(xì)胞的殺傷活性以及小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)人膀胱癌細(xì)胞株T24細(xì)胞的吞噬活性。

4、 結(jié)果：1.體外增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，活BCG和滅活BCG在濃度為3.6×103cfu/ml以下對(duì)小鼠脾細(xì)胞和人外周血單個(gè)核細(xì)胞無(wú)明顯促增殖作用，而當(dāng)濃度在3.6×103cfu/ml以上時(shí)則可明顯地促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞和人外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行增殖(p＜0.01)，并呈良好的劑量效應(yīng)關(guān)系?；頑CG對(duì)小鼠脾細(xì)胞和人外周血單核細(xì)胞的增殖作用比滅活BCG的作用明顯(p＜0.05)，并隨著濃度的增加其差異越顯著。活BCG和滅活BCG對(duì)小鼠脾細(xì)胞的增殖作用比

5、人外周血單核細(xì)胞的增殖作用明顯(p＜0.05)。 2.裂解活BCG提取其蛋白成分，經(jīng)紫外吸收法測(cè)定其蛋白質(zhì)純度A280nm/A260nm為1.75，用考馬斯亮蘭G250比色法測(cè)得提取物總蛋白含量為9.7mg/ml，提取物經(jīng)分離純化后可得三個(gè)組分BCGE1、BCGE2和BCGE3，其分子量分別為42.5kDa、36.3kDa和28.6kDa。 3.BCGE1在320μg/ml濃度以下對(duì)小鼠脾細(xì)胞無(wú)促增殖作用，也不能誘導(dǎo)小鼠

6、脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-12和TNF-α，在320g/ml濃度以上對(duì)小鼠脾細(xì)胞的增殖具有一定的促進(jìn)作用(p＜0.05)，并能誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生少量的IL-12、TNF-α(p＜0.05)，誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO(p＜0.05)。在濃度為640μg/ml時(shí)，BCGE1對(duì)小鼠脾細(xì)胞的增殖指數(shù)為1.35，誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12、TNF-α分別為96.87pg/ml和87.46pg/ml，誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO為3.67g

7、/ml。BCGE2和BCGE3在濃度為80μg/ml時(shí)就可以刺激小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行增殖和產(chǎn)生IL-12、TNF-α，以及誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO(p＜0.01)。在濃度為640μg/ml時(shí)，BCGE2對(duì)小鼠脾細(xì)胞的增殖指數(shù)為7.1，誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12、TNF-α分別為159.74pg/ml和128.94pg/ml，誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO為8.21μg/ml(p＜0.01)。在濃度為640μg/ml時(shí)，BCGE3對(duì)小鼠

8、脾細(xì)胞的增殖指數(shù)為4.66，誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12、TNF-α分別為128.76pg/ml和106.71pg/ml，誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO為7.62μg/ml(p＜0.01)。因此BCGE2對(duì)小鼠脾細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-12、TNF-α的作用，以及誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的作用比BCGE1和BCGE3都強(qiáng)。BCGE1、BCGE2和BCGE3都不能誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-4。 4.BCGE2可體外誘

9、導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞對(duì)膀胱癌細(xì)胞株T24細(xì)胞的殺傷作用，在效靶比為20：1時(shí)對(duì)T24細(xì)胞的抑制率為42.31％，而對(duì)照組僅為13.32％，兩者相比有非常顯著性差異(p＜0.01)。經(jīng)BCGE2體外誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性明顯增強(qiáng)，在效靶比為20：1時(shí)其抑制率為50.93％，而對(duì)照組僅為12.62％，兩者相比有非常顯著性差異(p＜0.01)。 結(jié)論1.活BCG和滅活BCG對(duì)小鼠脾細(xì)胞、人外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖活性都具有促進(jìn)作用，且隨