小鼠受精卵模擬微重力差異基因的驗(yàn)證及Ndufa4對(duì)其體外發(fā)育的影響.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室利用轉(zhuǎn)臂式生物反應(yīng)器(RWVB)所產(chǎn)生的模擬微重力環(huán)境對(duì)小鼠受精卵進(jìn)行體外培養(yǎng)，以平面培養(yǎng)作為對(duì)照，觀察模擬微重力環(huán)境對(duì)小鼠受精卵的影響情況。通過單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)C57小鼠受精卵在hCG20h、hCG后20h平面培養(yǎng)9h與hCG后20h微重力培養(yǎng)9h存在7個(gè)差異基因。本實(shí)驗(yàn)以昆明小鼠為研究對(duì)象，通過Q-PCR方法驗(yàn)證這七個(gè)差異基因：Tmem59、Teddm1b、1600010M07Rik、Lars2、Ndufa4、Nts和Papo

2、log的相對(duì)表達(dá)情況，與單細(xì)胞測序結(jié)果進(jìn)行比較計(jì)算準(zhǔn)確率。挑選出差異基因Ndufa4，通過Q-PCR、構(gòu)建載體、干擾、顯微注射等方法研究Ndufa4的功能機(jī)制。
　　以hCG20h為對(duì)照組（A組）、繼續(xù)平面培養(yǎng)9h（D組）、繼續(xù)微重力培養(yǎng)條件下培養(yǎng)9h（E組）。本實(shí)驗(yàn)室黨楠楠通過單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)：D與 E組表達(dá)差異1.5倍以上的基因共7個(gè)。本實(shí)驗(yàn)通過 Q-PCR方法在昆明小鼠受精卵對(duì) Tmem59、Teddm1b、1600010M0

3、7Rik、Lars2、Ndufa4、Nts和 Papolog這七個(gè)單細(xì)胞測序結(jié)果驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)：這七個(gè)基因在D組與E組相對(duì)表達(dá)量顯著差異的基因有Lars2、 Tmem59、Ndufa4和1600010M07Rik；D組與 E組相對(duì)表達(dá)量顯著不差異的基因?yàn)?Papolg與Nts；而 Teddm1b基因則由于表達(dá)量過低未檢測出。單細(xì)胞測序結(jié)果驗(yàn)證結(jié)果準(zhǔn)確率為66.7％。
　　初步篩選出Ndufa4基因，以hCG后20 h時(shí)雌雄原核均出現(xiàn)的狀

4、態(tài)作為受精標(biāo)志，構(gòu)建Ndufa4的表達(dá)載體與干擾SiRNA，通過顯微注射觀察對(duì)受精卵的發(fā)育影響。結(jié)果顯示：顯微注射后小鼠受精卵囊胚率顯著降低。
　　以hCG20h后顯微注射水為對(duì)照，顯微注射pEGFP-Ndufa4表達(dá)載體為實(shí)驗(yàn)組，通過Q-PCR檢測Bcl家族Bax、Bak、Bcl-xl和Bcl-2基因（其中Bax、Bak為促凋亡基因，Bcl-xl與Bcl-2為抑凋亡基因）的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明：過表達(dá)Ndufa4基因會(huì)使小鼠Ba

5、x與Bak顯著升高；引起細(xì)胞線粒體凋亡的蛋白cytC的相對(duì)表達(dá)量也顯著升高。
　　以hCG20h后顯微注射水為對(duì)照，顯微注射Ndufa4的SiRNA為實(shí)驗(yàn)組，通過Q-PCR檢測Bcl家族Bax、Bak、Bcl-xl和Bcl-2基因（其中Bax、Bak為促凋亡基因，Bcl-xl與Bcl-2為抑凋亡基因）的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明：干擾小鼠Ndufa4基因的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致Bax的相對(duì)表達(dá)量顯著升高；cytC的相對(duì)表達(dá)量也顯著升高。Ndufa4