小鼠受精卵模擬微重力差異基因的驗證及Ndufa4對其體外發(fā)育的影響.pdf

1、本實驗室利用轉(zhuǎn)臂式生物反應(yīng)器(RWVB)所產(chǎn)生的模擬微重力環(huán)境對小鼠受精卵進行體外培養(yǎng)，以平面培養(yǎng)作為對照，觀察模擬微重力環(huán)境對小鼠受精卵的影響情況。通過單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)C57小鼠受精卵在hCG20h、hCG后20h平面培養(yǎng)9h與hCG后20h微重力培養(yǎng)9h存在7個差異基因。本實驗以昆明小鼠為研究對象，通過Q-PCR方法驗證這七個差異基因：Tmem59、Teddm1b、1600010M07Rik、Lars2、Ndufa4、Nts和Papo

2、log的相對表達情況，與單細(xì)胞測序結(jié)果進行比較計算準(zhǔn)確率。挑選出差異基因Ndufa4，通過Q-PCR、構(gòu)建載體、干擾、顯微注射等方法研究Ndufa4的功能機制。
　　以hCG20h為對照組（A組）、繼續(xù)平面培養(yǎng)9h（D組）、繼續(xù)微重力培養(yǎng)條件下培養(yǎng)9h（E組）。本實驗室黨楠楠通過單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)：D與 E組表達差異1.5倍以上的基因共7個。本實驗通過 Q-PCR方法在昆明小鼠受精卵對 Tmem59、Teddm1b、1600010M0

3、7Rik、Lars2、Ndufa4、Nts和 Papolog這七個單細(xì)胞測序結(jié)果驗證發(fā)現(xiàn)：這七個基因在D組與E組相對表達量顯著差異的基因有Lars2、 Tmem59、Ndufa4和1600010M07Rik；D組與 E組相對表達量顯著不差異的基因為 Papolg與Nts；而 Teddm1b基因則由于表達量過低未檢測出。單細(xì)胞測序結(jié)果驗證結(jié)果準(zhǔn)確率為66.7％。
　　初步篩選出Ndufa4基因，以hCG后20 h時雌雄原核均出現(xiàn)的狀

4、態(tài)作為受精標(biāo)志，構(gòu)建Ndufa4的表達載體與干擾SiRNA，通過顯微注射觀察對受精卵的發(fā)育影響。結(jié)果顯示：顯微注射后小鼠受精卵囊胚率顯著降低。
　　以hCG20h后顯微注射水為對照，顯微注射pEGFP-Ndufa4表達載體為實驗組，通過Q-PCR檢測Bcl家族Bax、Bak、Bcl-xl和Bcl-2基因（其中Bax、Bak為促凋亡基因，Bcl-xl與Bcl-2為抑凋亡基因）的相對表達量。結(jié)果表明：過表達Ndufa4基因會使小鼠Ba

5、x與Bak顯著升高；引起細(xì)胞線粒體凋亡的蛋白cytC的相對表達量也顯著升高。
　　以hCG20h后顯微注射水為對照，顯微注射Ndufa4的SiRNA為實驗組，通過Q-PCR檢測Bcl家族Bax、Bak、Bcl-xl和Bcl-2基因（其中Bax、Bak為促凋亡基因，Bcl-xl與Bcl-2為抑凋亡基因）的相對表達量。結(jié)果表明：干擾小鼠Ndufa4基因的表達會導(dǎo)致Bax的相對表達量顯著升高；cytC的相對表達量也顯著升高。Ndufa4