對家蠶幾丁質(zhì)酶具強(qiáng)水解活性的彈性蛋白酶Chi-Elastase的分離及其相關(guān)分子基礎(chǔ)研究.pdf

1、本研究以家蠶幾丁質(zhì)酶作為靶標(biāo)，旨在自然環(huán)境中篩選分離幾丁質(zhì)酶抑制化合物產(chǎn)生菌；對篩選出的目的菌株進(jìn)行菌種鑒定、培養(yǎng)條件的優(yōu)化；在分離純化活性物質(zhì)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行活性物質(zhì)編碼相關(guān)基因的克隆分析和抑制機(jī)理的探討。 1.幾丁質(zhì)酶抑制物產(chǎn)生菌的篩選。 首先建立了幾丁質(zhì)酶抑制物簡易檢測方法——平板透明圈法，此法便于在初篩過程中進(jìn)行高通量篩選。以此方法從采自全國的200多份土樣中分離出的1350多株菌中篩選出五株幾丁質(zhì)酶抑制物產(chǎn)生菌；

2、復(fù)篩時使用鐵氰化鉀方法和3，5-二硝基水楊酸法確定了能穩(wěn)定生成幾丁質(zhì)酶抑制物的1237＃菌株。 1237＃菌株活性發(fā)酵液對幾種酶的抑制譜分析結(jié)果顯示1237＃菌株活性發(fā)酵液對鏈霉菌幾丁質(zhì)酶、沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶、假單胞菌幾丁質(zhì)酶及植酸酶、纖維素酶、a-淀粉酶無抑制效果，僅僅對家蠶幾丁質(zhì)酶具有強(qiáng)烈地抑制活性。 2.幾丁質(zhì)酶抑制物產(chǎn)生菌的菌種鑒定。 系統(tǒng)地進(jìn)行了1237＃菌株的分類鑒定。研究結(jié)果表明，1237＃菌株為革蘭

3、氏陰性桿狀細(xì)菌，菌體大小為0.5-0.8um×1.5-2um；是無芽孢，具鞭毛，能運(yùn)動的好氧菌；37℃在馬鈴薯固體培養(yǎng)基上生長18-24h菌體呈綠色；過氧化氫酶和氧化酶反應(yīng)均呈陽性；明膠水解反應(yīng)為陽性；膿青素反應(yīng)為陰性。最適生長溫度為37℃，4℃不生長，41℃能生長。以1237＃菌株基因組為模板，用細(xì)菌16SrRNA基因通用引物擴(kuò)增了1237＃菌株16SrRNA基因，擴(kuò)增片段與pMD-18T載體連接后，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coliDH5a

4、感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行測序分析。測得片段大小為1606bp，與NCBI核酸庫進(jìn)行比對分析的結(jié)果表明其與多種假單胞菌16SrRNA基因(GenBank登錄號：AF125317、AB117953、AJ249451)同源性在99﹪以上。 綜合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及16SrRNA基因測序分析結(jié)果，鑒定幾丁質(zhì)酶抑制物產(chǎn)生菌1237＃菌株為假單胞菌，命名為Pseudomonassp.1237＃。 3.幾丁質(zhì)酶抑制活性成

5、分的分離純化及性質(zhì)研究。 為建立合理的純化方法體系，首先探索了Pseudomonas.sp1237＃菌株代謝產(chǎn)物中幾丁質(zhì)酶抑制物的理化性質(zhì)。研究結(jié)果表明該幾丁質(zhì)酶抑制物不能耐受較高溫度，60℃處理30分鐘，活性喪失殆盡；不溶于有機(jī)溶劑，乙酸乙酯不能將其萃取提出，氯仿對幾丁質(zhì)酶抑制物活性具有很大的破壞作用；鹽析、有機(jī)溶劑沉淀等方法能將活性物質(zhì)沉淀析出。初步研究結(jié)果表明該幾丁質(zhì)酶抑制物為蛋白類物質(zhì)。 在對Pseudomona

6、s.sp1237＃菌株幾丁質(zhì)酶抑制物理化性質(zhì)有了初步了解的前提下，本研究借鑒蛋白質(zhì)純化的經(jīng)典策略，設(shè)計了活性物質(zhì)的純化方法體系，整個純化過程中始終追蹤其對家蠶幾丁質(zhì)酶的抑制活性。通過丙酮沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow開放柱、Superdex75低壓液相色譜純化活性物質(zhì)，純化得到的活性物質(zhì)經(jīng)HPLC檢測為單峰、SDS-PAGE檢測為單帶。 SDS-PAGE測定該幾丁質(zhì)酶抑制物的分子量在34KDa左右，測定其N-

7、端10個氨基酸序列為AEAGGPGGNQ。與NCBI核酸庫的比對結(jié)果表明，該活性物質(zhì)N-端10個氨基酸序列與假單胞菌彈性蛋白酶成熟蛋白(GenBank登錄號：AAZ81561)的前10個氨基酸序列同源性為100﹪。彈性蛋白酶檢測結(jié)果表明，該幾丁質(zhì)酶抑制物具有彈性蛋白酶活性。據(jù)此，本研究將Pseudomonas.sp1237＃菌株幾丁質(zhì)酶抑制活性成分命名為Chi-Elastase。 比較分析了Chi-Elastase及幾丁質(zhì)酶抑制

8、劑Allosamidin與家蠶幾丁質(zhì)酶相互作用以后SDS-PAGE電泳條帶的不同，電泳結(jié)果表明Chi-Elastase以一種不同于Allosamidin的方式對家蠶幾丁質(zhì)酶活性產(chǎn)生影響，Chi-Elastase通過降解家蠶幾丁質(zhì)酶而導(dǎo)致其喪失活性：Chi-Elastase與3種不同來源的幾丁質(zhì)酶相互作用后的非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳結(jié)果表明，Chi-Elastase只能降解家蠶幾丁質(zhì)酶，而對其它2種幾丁質(zhì)酶不產(chǎn)生任何影響； 用純品

9、注射四齡第一天家蠶的研究結(jié)果表明，Chi-Elastase能夠?qū)倚Q代謝產(chǎn)生影響，并在較高處理劑量時導(dǎo)致家蠶死亡。 4.Chi-Elastase生產(chǎn)條件的優(yōu)化。 研究結(jié)果表明以下條件是Pseudomonassp.1237＃菌株生成Chi-Elastase的理想條件：培養(yǎng)溫度37℃，牛肉膏、蛋白胨為氮源，葡萄糖為碳源，初始pH值為8.0，30﹪的裝瓶量。另外，[Fe]3+、[Mn]2+、[Ca]2+等金屬離子對Pseudo

10、monas.sp1237＃菌株生成幾丁質(zhì)酶抑制物具有極大的促進(jìn)作用。 5.Chi-Elastase編碼基因的克隆分析及表達(dá)研究。 以Pseudomonassp.1237?；蚪MDNA為模板，通過對Chi-ElastaseN端序列的比較分析，設(shè)計引物擴(kuò)增Chi-Elastase前體蛋白編碼基因。上游引物為：5，-GAGGAATTCATGAAGAAGGTTTCTACGCTT-3’；下游引物為5’-GAGCTCGAGTTACA

11、ACGCGCTCGGGCAGGT-3’；擴(kuò)增片段的測序分析結(jié)果表明該基因長度為1525bp，其與假單胞菌PA01彈性蛋白酶編碼基因的同源性在99﹪以上。擴(kuò)增基因的ORF分析結(jié)果表明Chi-Elastase前體蛋白全長498個氨基酸，其中N+端前197個氨基酸為信號肽或前導(dǎo)肽氨基酸序列，在蛋白質(zhì)折疊加工過程中被剪切。成熟蛋白質(zhì)由301個氨基酸組成，N端前十個氨基酸序列為AEAGGPGGNQ，與經(jīng)轉(zhuǎn)膜測序的N端10個氨基酸序列完全一致。OR

12、F分析結(jié)果表明，該基因編碼的氨基酸序列與假單胞菌PA01彈性蛋白酶氨基酸序列僅四個氨基酸存在差異。 設(shè)計表達(dá)引物擴(kuò)增Chi-Elastase成熟蛋白編碼序列，并將其與pET-28a(+)載體連接構(gòu)建原核表達(dá)載體Chi-Elastase/pET28a。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5a，篩選陽性表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入原核表達(dá)細(xì)菌E.coliBL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，檢測表達(dá)產(chǎn)物具幾丁質(zhì)酶抑制活性。 6.Chi-

13、Elastase特異性水解家蠶幾丁質(zhì)酶機(jī)理的初探。 Chi-Elastase抑制酶活性譜的研究表明，它能強(qiáng)烈地影響家蠶幾丁質(zhì)酶的活性，而對假單胞菌幾丁質(zhì)酶、鏈霉菌幾丁質(zhì)酶、沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶及植酸酶、纖維素酶、a-淀粉酶的活性幾乎不產(chǎn)生任何影響。鑒于Chi-Elastase對于不同來源幾丁質(zhì)酶作用效果呈現(xiàn)明顯差異，本研究主要通過比較分析4種不同來源幾丁質(zhì)酶一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的差異，推測產(chǎn)生這種特異性抑制作用可能存在的原因

14、。一級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明家蠶幾丁質(zhì)酶與假單胞菌幾丁質(zhì)酶氨基酸序列差異非常大，和沙雷氏菌、鏈霉菌氨基酸序列也有較大差距(尤其是活性位點(diǎn)的氨基酸組成)；二級結(jié)構(gòu)分析表明家蠶幾丁質(zhì)酶活性位點(diǎn)氨基酸全部處于松散結(jié)構(gòu)，而其它幾種幾丁質(zhì)酶活性位點(diǎn)氨基酸多數(shù)處于螺旋或者折疊結(jié)構(gòu)；幾丁質(zhì)酶功能結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明4種幾丁質(zhì)酶均具有糖基水解酶活性結(jié)構(gòu)域，它們結(jié)構(gòu)上的差異主要在于家蠶幾丁質(zhì)酶具有CHtBD2型幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而其余幾種幾丁質(zhì)酶不具有該結(jié)構(gòu)域；